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6 目的基因分离和克隆
Map-based cloning
DDRT PCR
DNA chip
RNA-sequence
Yeast two hybrid
河北农业大学生命科学学院,李莉云 6学时
1
本章基本要求
•基本要求:掌握目的基因的分离和克隆技
术原理和基本操作步骤,包括图位克隆技
术、差异显示技术、转录组测序、酵母双
杂交技术、基因芯片技术等。
•重点:图位克隆、DDRT-PCR、RNA-seq、酵
母双杂交、基因芯片。
•难点:染色体行走技术、DDRT-PCR、酵母
双杂交系统。
2
• 对已知序列基因的分离
核酸杂交法 √
PCR法 √
表达文库的免疫学筛选 √
• 对未知序列基因的分离
基因定位克隆 √
酵母双杂交 √
生物芯片 √
mRNA差异显示分析 √
RNA-seq √
3
• 自19世纪60年代以来,遗传学成为一门真正独立的
学科。在整个20世纪中,遗传学得到了日新月异的
发展,但这些发展从一开始的较长时间里都停留在
理论阶段。
• 随着核酸的发现、认识到核酸是遗传物质的载体,
再到揭示DNA的双螺旋结构、细胞遗传学的兴起和
新发现,遗传学的理论才真正与实实在在的实验基
础相结合。
• 20世纪70年代以来,研究手段得到了发展,人们第
一次能够操纵遗传物质。80年代PCR等技术的发明
,更使人们对遗传物质的研究达到了大众化的普及
。遗传学研究手段的不断进步,使人们在基因研究
的道路上大大前进了一步。
4
•正向遗传学是以目的基因所表现的功能为基
础, 通过鉴定其产物或某种突变表型而进
行,它研究的前提是某种突变体与野生型相
比具有显著的表型差异。
•反向遗传学着眼于基因本身, 通过特定的序
列或在基因组中的位置进行,因此图位克隆
技术显示出很好的前景
5
6.1 基因定位克隆
map-based cloning
图位克隆,是用于分离其编码产物未知的目的基因
的一种有效的方法。
具体步骤是先将目的基因的突变定位到染色体上,
并在目的基因的两侧确定紧密连锁的分子标记;以
分子标记作探针,筛选基因组文库,得到阳性克隆
;最后根据其同突变体发生遗传互补的能力鉴定出
目的基因。
从理论上讲,任何一种可鉴定出有一个突变的基因
,都可以通过基因定位克隆技术予以分离。
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