6b 目的基因分离6-120.pdf

6 目的基因分离和克隆 Map-based cloning DDRT PCR DNA chip RNA-sequence Yeast two hybrid 河北农业大学生命科学学院，李莉云 6学时 1 本章基本要求 •基本要求：掌握目的基因的分离和克隆技 术原理和基本操作步骤，包括图位克隆技 术、差异显示技术、转录组测序、酵母双 杂交技术、基因芯片技术等。 •重点：图位克隆、DDRT-PCR、RNA-seq、酵 母双杂交、基因芯片。 •难点：染色体行走技术、DDRT-PCR、酵母 双杂交系统。 2 • 对已知序列基因的分离 核酸杂交法 √ PCR法 √ 表达文库的免疫学筛选 √ • 对未知序列基因的分离 基因定位克隆 √ 酵母双杂交 √ 生物芯片 √ mRNA差异显示分析 √ RNA-seq √ 3 • 自19世纪60年代以来，遗传学成为一门真正独立的 学科。在整个20世纪中，遗传学得到了日新月异的 发展，但这些发展从一开始的较长时间里都停留在 理论阶段。 • 随着核酸的发现、认识到核酸是遗传物质的载体， 再到揭示DNA的双螺旋结构、细胞遗传学的兴起和 新发现，遗传学的理论才真正与实实在在的实验基 础相结合。 • 20世纪70年代以来，研究手段得到了发展，人们第 一次能够操纵遗传物质。80年代PCR等技术的发明 ，更使人们对遗传物质的研究达到了大众化的普及 。遗传学研究手段的不断进步，使人们在基因研究 的道路上大大前进了一步。 4 •正向遗传学是以目的基因所表现的功能为基 础， 通过鉴定其产物或某种突变表型而进 行，它研究的前提是某种突变体与野生型相 比具有显著的表型差异。 •反向遗传学着眼于基因本身, 通过特定的序 列或在基因组中的位置进行，因此图位克隆 技术显示出很好的前景 5 6.1 基因定位克隆 map-based cloning  图位克隆，是用于分离其编码产物未知的目的基因 的一种有效的方法。  具体步骤是先将目的基因的突变定位到染色体上， 并在目的基因的两侧确定紧密连锁的分子标记；以 分子标记作探针，筛选基因组文库，得到阳性克隆 ；最后根据其同突变体发生遗传互补的能力鉴定出 目的基因。 从理论上讲，任何一种可鉴定出有一个突变的基因 ，都可以通过基因定位克隆技术予以分离。