2020-第4章-荧光.在核酸分析中的应用(1).pptVIP

PCR分四个阶段 如何定量？ 基线(baseline)：一般以PCR反应前15个循环的荧光信号作为本底信号 荧光阀值(threshold)：扩增曲线上人为设定的一个值 -- 缺省设置：PCR反应前3-15个循环荧光本底信号标准偏差的10倍 -- 手动设置：大于样本的荧光背景值 CT值：PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的阈值所对应的循环次数。 注意！ 从基线到指数增长的拐点所对应的循环次数CT值必须位于指数增长阶段内！ 定量原理 确定初始模板的浓度 初始 DNA量越多, 荧光达到某一值（域值）时所需要的循环数越少。 Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数就可计算出样品中所含的模板量。 * . Rn vs. Cycle number-- 扩增曲线 LogDNA vs. Ct -- 标准曲线 . 未知 104 103 106 105 102 10 标准曲线 (standard curve) 荧光定量PCR的临床应用 (1)感染性疾病的诊断 ①病原体含量与病情之间的关系 ②病原体含量与用药之间的关系 ③药物及疗法的研究与开发 ④新的病原体分子诊断标准 ⑤新的愈后指标 ⑥传染病发病的监控、预测与预防 (2)母婴传播的控制与观察 (3)遗传疾病的诊断 （a、b-地中海贫血、唐氏综合症、性别连锁遗传病） ①等位基因检测 ②多基因遗传病的突变检测 ③基因表达异常所致遗传病检测 (4)肿瘤的诊断 (HPV-宫颈癌；EBV-鼻咽癌；HP-胃癌) ①肿瘤标志物：癌胚抗原、同功酶、抗体、激素、细胞因子、受体等。 ②肿瘤相关基因表达的检测：包括癌基因抗癌基因、肿瘤转移基因及转移抑制基因。 (5)法医学鉴定 ① .亲子鉴定 ②.法医物证 ③.PCR-RFLP技术的法医学应用 ④ .罪犯鉴定 在检测 A物质在水溶液中的荧光性质时，激发光波长设定 在500nm。请问，拉曼散射峰的波长应该是多少? * * * * 第4章 荧光在核酸分析中的应用 内转换（Internal Conversion，IC）: 对于具有相同多重度的分子，若较高电子能级的低振动能层与较低电子能级的高振动能层相重叠时，则电子可在重叠的能层之间通过振动耦合产生无辐射跃迁，如S2-S1；T2-T1。 系间跨跃（Intersystem Conversion，ISC）:系间跨跃是发生在两个不同多重态之间的无辐射跃迁，如从S1到T1，该跃迁是禁阻的。然而，当不同多重态的两个电子能层有较大重叠时，处于这两个能层上的受激电子的自旋方向发生变化，即可通过自旋-轨道耦合而产生无辐射跃迁，该过程称为系间跨跃。 荧光:分子电子从单重激发态的最低振动能级在很短时间（10-9-10-6s）跃迁到基态各振动能层时所产生的光子辐射称为荧光。 磷光: 分子电子从三重态最低振动能层，跃迁到基态的各振动能层所产生的辐射。 振动弛豫（Vibrational Relaxation, VR）: 在液相或压力足够高的气相中，处于激发态的分子因碰撞将能量以热的形式传递给周围的分子，从而从高振动能层失活至低振动能层的过程，称为振动弛豫。 外转换（External Conversion，EC) :受激分子与溶剂或其它分子相互作用发生能量转换而使荧 光或磷光强度减弱甚至消失的过程，也称“熄灭”或“猝灭”。 （一）荧光产生的原理 瑞利散射 激发波长太长，其能量不足以使分子中的电子跃迁到电子激发态，但能将电子激发到基态中较高振动能级。若电子在受激后能量没有损失并在瞬间（10-12s)内又回到原来的能级。于是便在各个不同的方向发射出与激发光波长相同的辐射。 拉曼散射 被激发至基态中较高振动能级的电子,当返回到比原来稍低的振动能级时,便产生波长略长于激发波长的拉曼散射光.拉曼光的强度远比瑞利散射和荧光弱. （二）散射光的干扰 拉曼散射峰与激发光波长的关系 荧光谱带有特征波峰,而拉曼光的波长是随激发光的波长的改变而改变. 1/?ex-1/?x=0.338 ?x对应峰就是拉曼散射峰 拉曼散射峰的位置随激发波长的改变而变化,是可以预测和计算出来的. Ru(phen)2(dppz)2+-DNA 的激发-发射光谱 (?ex=453nm). a. Ru(phen)2(dppz)2+溶液 b. Ru(phen)2(dppz)2+-DNA溶液 453nm 598nm 535nm 波数 ? 波长的倒数,每厘米长度内含有 波长的数目,单位cm-1.波数的换算关系 如右图,哪一个发射峰 为拉曼散射峰? υ:宇普西龙 Upsilon ?/cm-1=1/(?,cm)=104/(?,?m) 1cm=104 ?m, 1 ?m=103nm ?453=453nm=0.453 ?m ?598=