2020ES细胞的诱导与应用.pptVIP

ES 细胞的诱导与应用 本次课的主要内容 一． ES 细胞的定义，及其研究发展史。 二． ES 细胞的分离培养和生理特性。 三． ES 细胞的自我更新，诱导分化。 四． ES 细胞的应用前景和所面临的挑战。 一、什么是 ES 细胞 ? 一般来讲， ES 细胞是指从早期的囊胚中的内细胞 团（ inner cell mass, ICM) 分离得到的具有无限 增殖能力和多分化潜能的一类干细胞。 ? 两个重要特性： （ 1 ）多潜能性分化，可分化成三胚层以内的所有 细胞。 （ 2 ）可无限的保持未分化状态，扩增传代。 有关干细胞的概念 一、定义 ： 具有自我复制的能力，在一定条件下能够分化成 各种功能细胞。 二、分类 ： (1) 全能干细胞 ： 具有全能性，可以分化成全身 200 多种 细胞类型，进一步形成机体的任何组织和器官， 该类细胞包括，胚胎干细胞（ embryonic stem cells) 和生 殖干细胞（ embryonic germ cells). (2) 多能干细胞 ：具有分化成多种细胞和组织的潜能，但却 失去了发育成完整个体的能力。 (3) 转能干细胞 ：只能向一种或密切相关的两种细胞类型 的细胞分化。 二、胚胎干细胞研究的进展情况： ? 1981 年， Evans 和 Martin 分别成功的分离和体外培养了小 鼠的胚胎干细胞。 ? 1995 年， Thomson 等人分离建立了第一株灵长类动物的胚 胎干细胞。 ? 1998 年， Thomson 等建立了第一株人类胚胎干细胞。 ? 1998 年， Shamblott 等建立了第一株人类生殖干细胞。 ? 2006 年， Yamanaka 建立诱导多能干细胞（ induced pluripotent stem cell, IPS ） 胚胎干细胞系的建立过程 ? 分离囊胚的内细胞群 ? IPS 与成纤维细胞共培养， ES 细胞 非分化增殖 ? 分离胚胎生殖腺脊细胞 ? ------ ? 胚胎干细胞的鉴定 ------ ? 定向诱导分化 ---- --- ? 成体干细胞 ----- ? 功能细胞 ES 细胞培养过程 利用体细胞核移植技术获取 ESC ES 与 EG 细胞 ES 细胞培养过程 小鼠胚胎成纤维细胞 的处理方法： 1 、 γ - 射线照射法。 2 、丝裂霉素处理法。 目的：使得作为饲养 层的成纤维细胞停止 分裂，但又不至于马 上死亡，在体外维持 一段时间生命，为 ES 细胞提供维持其生长 和未分化状态的诸多 细胞因子。 IPS 三、 ES 细胞的细胞特性 ? 1 、细胞形态： 与早期胚胎细胞相似的形态结构特征， 胞体体积小，核大，有一个或多个核仁， 核仁清晰，多为常染色质，胞质结构简单， 散布大量核糖体和线粒体。核型正常，具 有稳定的整倍体核型。 三、 ES 细胞的细胞特性 2 、生长特性： ES 细胞在体外分化抑制培养时，呈克隆状生长， 细胞紧密的聚集在一起，圆形或卵圆形，细胞均 呈单层或多层紧密堆积，形成岛状或巢状的群体 细胞克隆，细胞之间的界限不清，克隆周围可见 单个 ESC 和分化的扁平状上皮细胞。 四、 ES 细胞的分子生物学标志 1 、碱性磷酸酶（ AKP ） ES 细胞含有丰富的碱性磷酸酶，活性高。但在已经分化的 ES 细胞中碱性磷酸酶则呈弱阳性或阴性，因此常作为 ES 细胞鉴别和 区分 ES 细胞分化与否的重要标志之一。 2 、端粒酶 ES 细胞表现出高水平的端粒酶活性，不同于正常的二倍体细 胞，可能是其复制生命期限远比体细胞长的原因。研究发现，端 粒酶的减少是细胞衰老的重要机制之一，但在 ES 细胞、生殖细胞 和肿瘤细胞中，端粒酶呈高水平表达，具有高活性，在细胞每次 分裂之后，可保持端粒长度，进而维持细胞的长期存活。 四、 ES 细胞的分子生物学标志 3 、胚胎阶段特异性表面抗原（ SSEA ） SSEA 是一种糖蛋白，常表达于胚胎发育早期的 细胞， ES 细胞中 SSEA 表达阳性，可作为 ES 细胞的 标记分子之一，用于鉴别。 然而，不同种属的动物，其表面抗原组成并不 完全一致。 人 ES 细胞 小鼠 ES 细胞 SSEA-1 － ＋ SSEA-3 ＋ － SEA-4 ＋ － TRA-1-60 ＋ － TRA-1-81 ＋ － AKP ＋ ＋ 端粒酶活性 ＋ ＋ 滋养细胞 ＋ ＋ 培养条件 滋养细胞 滋养细胞 / LIF 五、 ES 细胞的诱导分化 当鉴别一株细胞是不是 ES 细胞时，除了要经过 以上的检测：形态和生长特性，染色体核型分析， 特异性表面抗原等。更重要的是要看其是否具有 多分化潜能。 ESC 的诱导分化一般