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精品文档 实验 4 细胞融合 〔实验目的〕 1、 了解细胞融合的原理 2、 掌握 PEG 介导细胞融合过程的操作 〔实验原理〕 聚乙二醇（ PEG）分子能使细胞凝集，改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处的细胞膜脂类分子发生疏散和重组， 由于两细胞间接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，使细胞发生融合。 〔试剂材料〕 1、仪器：倒置显微镜、水浴锅 2、试剂 1） 0.85%生理盐水 2） GKN 液 NaCl 8g, KCl 0.4g, Na 2HPO4.2H 2O 1.77g, NaH 2PO4. H 2O 0.69g, 葡萄糖 2g，酚红 0.01g，溶于 1000ml 重蒸水中。 3） 50%PEG 液 临用前配制， 50g PEG4000 ，在沸水浴中加热， 冷却至 50℃时加入预热至 50℃的 50ml GXN 液，混匀， 37℃备用。 3、材料：鸡红细胞悬液 〔内容方法〕 1、 抗凝的鸡血，加入 4 倍体积的 0.85%生理盐水，为血细胞储备液， 4℃冰箱可保存一周 2、 鸡血储备液 1ml ，加入 4ml 生理盐水，混匀后 1200r/min 离心 5min，去上清，再加入生 理盐水同样条件下离心一次。血细胞沉淀加入 10mlGKN 液制成鸡血细胞悬液 3、 取悬液进行计数，用 GXN 将红细胞稀释至 3-4×107 个 /毫升浓度。 4、 取稀释好的红细胞悬液 1ml ，加入 0.5ml 50%PEG 混匀， 37℃/39℃温浴 20-30min 。 5、 加入 GKN 溶液至 8ml ， 37℃温浴 20min 。 6、 1200r/min 离心 5min，沉淀用 GKN 溶液再洗一次。 7、 收集沉淀，涂片，镜检。 也可采用下面方法： 1、 细胞生理盐水洗涤后用 GKN 溶液制成 5%悬液 2、 红细胞悬液 1ml ， 1200r/min 离心 5min，去上清 。 3、 细胞沉淀用手指轻弹使细胞疏松，再逐滴滴加 50%PEG 溶液 0.5ml ，1 分钟之内加完 ， 边滴加边轻晃细胞 ，使 PEG 与血细胞混合 4、 混合物在 37℃温浴 2min。 5、 加入 GKN 2ml ， 37℃温浴 5min 。 6、 1200r/min 离心 5min，去大部分上清，沉淀涂片，晾干后观察。 细胞融合过程： ①两细胞膜接触，粘连；②细胞膜形成穿孔；③两细胞的细胞质连通；④通道扩大，两细胞 . 精品文档 连成一体；⑤细胞完全合并，形成一个含有两个或多个核的圆形细胞。 〔注意事项〕 1、 高 Ca2+浓度（ 1.27-1.80mmol/L ）和高 pH8.0-8.2 能够提高细胞融合率。溶液中尽量减少可与 Ca2+结合的溶质分子。 2、 必须严格控制 PEG 作用时间，通常处理 1-2 分钟。 PEG 和 DMSO 共同作用可提高细胞 融合率 3、 相对分子量在 400-6000 的 PEG 在 40%-60% 浓度范围内都能使细胞融合。 一般来说，PEG 浓度和分子量越大，细胞 融合率越高，但其黏度和细胞毒性也增大。所以 PEG 浓度在 40%、45% 、 50%时以 PEG1000 的融合效率最佳。浓度为 55%-60% 时以 PEG400 为佳。 〔实验作业〕 1、绘制观察到的融合细胞 2、计算融合率 .