第十七章 PCR基因扩增仪.docVIP

PAGE PAGE 1 第十七章 PCR基因扩增仪 首 页 HYPERLINK 重点难点 HYPERLINK 讲授学时 HYPERLINK 内容提要 1 基本要求 1.1了 解 (1) PCR扩增仪的操作规程 (2) PCR扩增仪常见故障的排除 (3) PCR扩增仪的应用 1.2 熟 悉 (1) PCR技术的原理 (2) PCR扩增仪的种类 (3) 水浴锅PCR基因扩增仪的温度控制 (4) 压缩机PCR基因扩增仪的温度控制 (5) 荧光实时定量PCR（RQ-PCR）技术原理 (6) 各孔独立控温的定量PCR仪的特点 1.3 掌 握 (1) PCR基因扩增仪的工作原理 (2) PCR基因扩增仪的常用变温方式 (3) 梯度PCR仪的功能和特点 (4) 原位PCR仪的功能和特点 (5) 实时荧光定量PCR扩增仪的种类 (6) 金属板式实时定量PCR仪的特点 (7) 离心式实时定量PCR仪的特点 (8) PCR基因扩增仪的主要性能指标 2 重点难点 2.1重 点 (1) PCR基因扩增仪的工作原理 (2) 实时荧光定量PCR扩增仪的种类及各自特点 (3) PCR基因扩增仪的主要性能指标 2.2 难点 (1)梯度PCR仪的功能和特点 (2)原位PCR仪的功能和特点 (3)各孔独立控温的定量PCR仪的特点 3 讲授学时 建议6学时 4 内容提要 4.1 PCR基因扩增仪的工作原理 4.1.1 PCR技术 1. PCR技术的本质是核酸扩增技术，重复“变性(denature)→退火(anneal)→引物(primer)延伸(extension)”过程至25～40个循环，呈指数级扩大待测样本中的核酸拷贝数，达到体外扩增核酸序列的目的。 图17-1 PCR的基本原理 2. 在PCR技术的发展过程中，热稳定DNA聚合酶的发现以及温度循环的自动化大大简化了PCR程序，使PCR的自动化成为可能，并在此基础上不断发展和改进。 4.1.2 PCR基因扩增仪的工作原理 PCR基因扩增仪工作关键是温度控制。 1.水浴锅控温：以不同温度的水浴锅串联成一个控温体系。 2.压缩机控温：由压缩机自动控温，金属导热，控温较第一代PCR基因扩增仪方便，但压缩机故障率高，边缘效应及温度overshooting现象严重。 3. 半导体控温：由半导体自动控温，金属导热，控温方便，体积小，相对稳定性好。 4. 离心式空气加热控温：由金属线圈加热，采用空气作为导热媒介，温度均一性好，各孔扩增效率高度一致，满足荧光定量PCR的高要求。 4.2 PCR扩增仪的分类与结构 PCR扩增仪的种类总体来说，可以分成两大类，即普通PCR扩增仪和实时荧光定量PCR扩增仪。 4.2.1 普通PCR扩增仪 1.普通PCR扩增仪即通常所谓的定性PCR扩增仪。 2.梯度PCR仪是由普通PCR仪衍生出的带梯度PCR功能的基因扩增仪。 3.原位PCR仪是由普通PCR仪衍生出的带原位扩增功能的基因扩增仪。 4.2.2 实时荧光定量PCR扩增仪 1.金属板式实时定量PCR仪，还可作为普通PCR仪使用，有的甚至带梯度功能，可容纳的样本量大，无需特殊耗材，但温度均一性欠佳，有边缘效应，校正曲线的反应条件难以做到与样品完全一致。 2.离心式实时定量PCR仪的PCR扩增样品槽被设计为离心转子，温度均一性好，但可容纳样品量少，有的需用特殊毛细管作样品管，增加了使用成本，也不带梯度功能。 3.各孔独立控温的定量PCR仪的不同样品槽分别拥有独立的智能升降温模块，各孔独立控温，适合多指标快速检测，可实现任意梯度反应，但上样不如传统方法方便，而且需要独特的扁平反应管，使用成本较高。 4.3 PCR扩增仪的性能指标、操作规程及常见故障的排除 4.3.1 1.温度控制是决定PCR反应能否成功的关键，主要包括温度的准确性、均一性以及升降温速度。对梯度PCR仪来说，还必须考虑仪器在梯度模式和标准模式下是否具有同样的温度特性。 2.荧光检测系统：实时荧光定量PCR扩增仪均有荧光检测系统，主要包括激发光源和检测器。 3.软件：简便的人性化设计最能满足其需求。 4.多样化样品基座设计、热盖等都使PCR仪越来越人性化。 4.3.2 普通PCR扩增仪的操作通常非常简便，打开电源，仪器自检，设置温度程序或调出储存的程序，运行即可。定量PCR扩增仪的操作其实和普通PCR仪无多大差别。 4.3.3 4.4 PCR扩增仪的应用 4.4.1感染性疾病的分子诊断和研究 4.4.2遗传性疾病的分子诊断和研究 4.4.3恶性肿瘤的分子诊断和研究 4.4.4 PCR 4.4.5 PCR 4.4.6 PCR扩增仪在分子生物学其他领域的应用