碱性磷酸酶的分离纯化 袁野20101009.pptVIP

碱性磷酸酶 (AKP) 的分离纯化 生物化学与分子生物学系 袁野 实验目的 : 从兔肝中提取碱性磷酸酶的实验，培养 同学综合运用有机溶剂沉淀、离心、分光等 方法，从组织中分离纯化及鉴定特定蛋白质 的技能。 实验原理： 采用有机溶剂分步沉淀法，从兔肝中提取碱 性磷酸酶。 AKP 溶于 30% 乙醇或 33% 丙酮 。但在 60% 的乙醇 或 50% 丙酮 中则形成沉淀。通过离心可以使 AKP 和其他蛋白分离，从而得到纯化。 反复进行纯化的操作，可以获得较高纯度 的 AKP 。 有机溶剂沉淀 ? 概念：在含有溶质的水溶液中加入一定量亲水的 有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出 。 ? 原理 ： （ 1 ） 降低了溶质的介电常数，使溶质之间的静电 引力增加，从而出现聚集现象，导致沉淀。 （ 2 ） 由于有机溶剂的水合作用，降低了自由水的 浓度，降低了亲水溶质表面水化层的厚度，降低 了亲水性，导致脱水凝聚 。 常用的有机溶剂沉析剂 ? 乙醇：沉析作用强，挥发性适中，无毒常用于蛋 白质、核酸、多糖等生物大分子的沉析； ? 丙酮：沉析作用更强，用量省，但毒性大，应用 范围不广； ? 特点： ? 介电常数小 : 60% 乙醇的介电常数是 48 丙酮的介电常数是 22 ? 容易获取 有机溶剂沉析的特点 ? 分辨率高； ? 溶剂容易分离，并可回收使用； ? 产品洁净； ? 容易使蛋白质等生物大分子失活； ? 应注意在低温下操作； 影响有机溶剂沉析的主要因素 ? 温度：低温有利于防止溶质变性；有利于提高收率 （溶解度下降）； ? 搅拌速度：散热 ? 溶液 pH 值：原则是避免目标蛋白与杂质带有相反的 电荷，防止共沉现象。（ pI ） ? 离子强度 : 离子强度低有利于沉析， 0.01~0.05mol/L ? 样品浓度 : 0.5~2% 稀：溶剂用量大，回收率低，但共沉淀作用小 浓：节省溶剂用量，共沉作用强，分辨率低 ? 金属离子的助沉析作用： Zn 2+ 、 Ca 2+ 1. 称取兔肝 2g , 剪碎后置于玻璃匀浆器中，加入 0.01 M 的醋酸镁及醋酸钠混合液 4ml , 进行 匀浆。转入离心管，并加 2ml 0.01 M 的醋酸 镁及醋酸钠混合液清洗匀浆器，之后将之倒 入离心管，与原来的匀浆液混合。记录 体积 a ， 取 0.1ml 作为 A 液 于 EP 管，待测比活性用。 2. 在离心管中剩余的液体加入 2ml 正丁醇， 玻璃棒搅拌 2min ，室温放置 30min ，纱 布过滤，置于离心管。 3. 滤液加入 等体积的冷丙酮 ，边倒边摇， 混匀后 3000r/min 5min 。 弃上清 ，沉淀 用 4ml 0.5M Mg(AC) 2 溶解。记录 体积 b 。 取 0.1ml 作为 B 液 于 EP 管，待测比活性用。 4. (1) 于悬液中 缓慢 加入冷 95% 乙醇使其终体积为 30% （ 0.46 体积 ），混匀后 2000r/min 5min ，转移 上 清 于另一离心管。 (2) 上清液中 缓慢 加入冷 95% 乙醇使其终体积为 60% （ 0.85 体积 ），混匀后 3000r/min 5min ， 弃上清 ， 沉淀用 4ml 0.01M Mg(AC) 2 、 NaAC 混合液搅拌混 悬。 5. (1) 于悬液中 缓慢 加入冷 95% 乙醇使其终体积为 30% （ 0.46 体积 ），混匀后 2000r/min 5min ，转移 上 清 于离心管，弃沉淀。 (2) 上清液中 缓慢 加入冷 95% 乙醇使其终体积为 60% （ 0.85 体积 ），混匀后 3000r/min 5min ， 弃上清 ， 沉淀用 3ml 0.5M Mg(AC) 2 溶解 , 记录 体积 c 。取 0.1ml 作为 C 液 于 EP 管 , 待测比活性用。 6. （ 1 ） 其余悬液中 缓慢 加入冷丙酮，使得丙酮的体积分 数达到 33% （ 0.5 体积），混匀后 2000r/min 离心 5min ， 取上清 （弃沉淀） （ 2 ） 上清中 缓慢 加入冷丙酮，使丙酮终体积分数达到 50%(0.34 体积），混匀后 3000r/min 离心 15min ， 弃上 清 （ 3 ） 沉淀中加入 Tris- 醋酸镁缓冲液 5ml ，即为纯化酶液。 作为 D 液 用于比活性测定。 ? 用于活性测定： 用 Tris-Mg(AC) 2 缓冲液将