(论文格式)纤维素降解菌的筛选及其发酵产酶条件分析研究.docx

纤维素降解菌的筛选及其发酵产酶条件研 究李莹姝 阎淑珍（南京师范大学生命科学学院，南京 210046） 摘要： 纤维素酶是一种分解纤维素的高活性生物催化剂，具有广泛的应用价值。为了获 得高活性的纤维素降解细菌，对从南京师范大学北区枯叶堆及其附近土壤采集的样品进行 富集和刚果红纤维素平板初筛，得到 6 株产纤维素分解酶的菌株，其中 5 株为细菌（ B1 、 B3、B4、B8、B10）， 1 株可能为真菌 （B10） 。经过水解圈复筛，得到两株产酶活性较高的 细菌菌株 B3、B10，经过细菌形态观察及生理生化鉴定，初步鉴定 B3为革兰氏阳性杆菌 （可能为巨大芽孢杆菌）、 B10为革兰氏阳性杆菌。经过摇瓶发酵，测定其 CMCase、FPA 酶活力，结果表明 B3和B10两菌株分别在培养第三天后所产 CMC酶的活力达到最高，分 别为55.09 U/mL和44.99 U/mL，并且两株菌均在培养基 PH为8时酶活力最高。B3菌株基 本没有FPA酶活力，B10菌株在培养三天后 FPA酶活力达到最高104.14 U/mL,。可进一步 通过紫外诱变育种等方法提高产酶量及酶活性，进行进一步研究。 关键词： 纤维素酶，微生物，筛选鉴定，酶活 纤维素是自然界分布最广、最丰富、最廉价的可再生性有机资源和多糖物质，随着地球 上不可再生资源日益耗竭，如何有效转化和利用这一丰富资源，成为各国关注的重要领域 [1]。发展和利用生物技术分解转化天然纤维素原料，得到可利用的糖，再进一步转化为燃 料乙醇、燃气等能源物质或者菌体蛋白等食品，成为当前国际研究的热点。 [2]采用微生物 技术解决这一问题是当前研究最多方法。目前研究较多的是霉菌 , 尤以绿色木霉、里氏木霉 和康氏木霉为典型 [3] ,对细菌研究较少。分离筛选能够高产纤维素酶 , 有效降解纤维素的微 生物菌种是应用纤维素材料的首要前提，高产降解纤维素细菌的获得、得到比较稳定的菌 剂及应用于工农业上 , 对解决当今世界所面临的粮食短缺、饲料资源紧张、能源危机和环境 污染等问题具有深远的意义 [4] 。 土壤中的微生物，大约 70%~90%是细菌。细菌适宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生 长，绝大多数分布在距地表约 3-8cm 的土壤层。因此，土壤取样时，一般要铲去表层土。 另外，土样的采集要选择富含纤维素的环境，这是因为在纤维素含量丰富的环境，通常会 聚集较多的分解纤维素的微生物。 本实验从腐烂枯叶附近的土壤中分离筛选能降解纤维素的细菌，通过富集，刚果红初 筛，水解圈大小复筛，测定菌株的 CMC 酶活力和 FPA 酶活力，从而得到产纤维素酶活力 较高的两株菌，通过形态观察、生理生化实验初步鉴定菌种。 1 材料和方法 1.1菌种来源 采集：综合各种因素，本小组图样采集于南京师范大学仙林校区生地图书馆后的土壤。在 不同的 3 个地点采样。土样 1 ：腐烂叶下；土样 2:竹叶下；土样 3：背阳面枯叶堆。 1.2 试剂与仪器 DNS 试剂（ 3， 5-二硝基水杨酸），柠檬酸 -磷酸盐缓冲液（ pH 6~8），碳酸钠 -碳酸氢钠缓 冲液（pH 9）, 0.51%羧甲基纤维素钠溶液（CMC ）, 1mg/mL葡萄糖标准液。 恒温培养箱、恒温烘箱，恒温水浴锅，控温摇床、全自动灭菌锅、电磁炉、微波炉、离心 机、精密分析天平，托盘天平， 721 分光光度计， 20mL 具塞刻度试管， 20ml 试管， pH 计 （酸度计），容量瓶，移液管（ 0.5mL， 2mL） ，小口瓶、烧杯、量筒等。 A O拉美苴 1.3 培养基 富 集 培 养 基 ： 纤 维 素 粉 2.5g ， NaNO3 0.5g， Na2HPO4?7 H2O 0.25g,KH2PO4 0.45g ,MgSO4?7 H2O 0.25g ,KCl0.25g , 酵母粉 0.25g ，溶解定容至 500ml； 刚果红纤维素培养基： 纤维素粉 1.88g， MgSO47H2O 0.25g， K2HPO4 0.5g ，刚果红 0.2g，琼脂14.0g，明胶2g，蒸馏水1000mL ; 刚果红纤维素钠培养基： CMC-Na 10g，酵母膏1g,琼脂15g，明胶2g，K2HPO4 0.5g， MgSO4?7 H2O 0.25g，刚果红 0.05g，蒸馏水 1000mL ； 酶活培养基 (g/L): CMC-Na 5.0 g, 蛋白胨 2.5 g, 酵母膏 0.5 g, MgSO4 0.3 g, KH2PO4 2.0 g, NaCl 1.0 g,(NH4)2SO4 1 .4 g, CaCl2?2H2O 0.3 g, FeSO4?7H2O 0.005 g,MnSO4 0.0016 g, ZnC12 0.0017 g,定容至1000mL，自然pH；牛肉膏蛋白胨培养基(NA)：牛肉