基因工程重点总结2.docVIP

PAGE 6 绪 论 1、重组DNA技术：是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。 因此，供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。 4、基因工程的基本操作程序（P7） （1）.从供体生物的基因组中分离获取带目的基因的DNA片段 （2）限制性核酸内切酶将含有外源DNA和载体分子切开 (3)DNA连接酶将含有外源基因的DNA片段连接到载体分子上，形成DNA重组分子 (4)将重组DNA分子引入到受体细胞 （5)带有重组体的细胞培养拓增，获得大量的细胞繁殖群体 （6）筛选和坚定转化细胞，获得使外源基因高效稳定表达的记忆工程菌或细胞 (7）将选出的细胞克隆的目的基因进一步演剧分析，并设法使之实现功能蛋白的表达 第二章 基因工程的工具酶 一、限制性核酸内切酶P15：是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（4—8bp），并由此处切割DNA双链的核酸内切酶 hsd R：编码限制性核酸内切酶 hsd M：编码限制性甲基化酶 hsd S：表达产物协助酶识别特殊的作用位点。 粘性末端的意义P ①连接便利 i）不同的DNA双链 只要粘性末端碱基互补就可以连接。 ii）同一个DNA分子内连接： 通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。 ② 5’末端标记 凸出的5’末端可用DNA多核苷酸激酶进行32P标记。 凸出的3’端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等）造成人工粘性末端。 ③ 补平成平齐末端 粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端。 2、同裂酶：是不同来源分离出来的不同酶，但具有相同的识别顺序，切割DNA的方式可以相同，也可不同。如XmaI和SmaI 3、同尾酶：它们是不同的酶，但切割后可产生相同的粘性末端，因此同尾酶的切割片断之间可以相互连接，这种酶在分子生物学中有较大的价值。 4、远距离裂解酶：这类酶的识别位点与切割位点不一致，它们在某一核苷酸区域与识别顺序结合，然后滑行到识别顺序以外的另一个位点进行切割。 5、可变酶：这类酶是II型酶中的一个特例，它们的识别顺序中的1个或几个核苷酸是可变的，并且其识别顺序—般大于6个碱基对。 6、II 型限制性核酸内切酶酶解注意事项 ①浓缩的酶应该用缓冲溶液稀释，稀释后应尽快用完； ②保存在50%甘油中，-20度条件下； ③ 酶切反应的时候，最后加酶； ④酶从冰箱中取出后应该放置于冰上或者冰盒上； ⑤酶应该分成小份，避免反复冻融； ⑥取酶要用新的灭菌的吸头，避免污染； ⑦加酶的体积不要超过反应体系的1/10。 影响限制性核酸内切酶活性的因素 ①DNA样品的纯度 蛋白质、酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS等 解决方法：加大酶的用量，1 mg DNA 用 10U 酶 加大反应总体积，延长反应时间。 ② DNA甲基化程度 ③ 反应条件 高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即Star activity现象。 EcoR I在正常条件下识别并切割5‘GAATTC3’序列，但在甘油浓度超过5%，可切割5‘PuPuATPyPy3’ ④酶的纯度 ⑤酶切反应的温度和时间 大多数的内切酶，最适反应温度为37度，但也有例外，如Sma I 为25度。酶解时间可以通过加大酶量而缩短。 8、限制性内切酶的命名 二、DNA连接酶 1. 两种DNA连接酶 （1）大肠杆菌连接酶 需要 NAD作物辅助因子只能连接粘性末端。 T4噬菌体DNA连接酶 以ATP作为辅助因子；不但能连接粘性末端；还能连接齐平末端；RNA:DNA杂交分子中RNA上的缺口。 2. T4噬菌体RNA连接酶 以ATP作为辅助因子；催化单链DNA或RNA的 5‘-p与3’-OH共价链接 （1）连接条件 必须是两条双链DNA。 DNA3’端有游离的-OH，5’端有一个磷酸基团（P）。 需要能量 动物或噬菌体中：ATP ；大肠杆菌中：NAD+ 只能连接相邻核苷酸之间的缺口 3. 影响连接反应的因素 (1)DNA末端的浓度 (2)反应温度 （3）ATP浓度 三、常用的DNA聚合酶的特点 1. 共同特点 把dNTPs连续地加到引物的3’—OH端。 2. 主要区别 持续合成能力和外切酶活性不同 3. DNA聚合酶在基因工程中的用途 大肠杆菌DNA聚合酶I ?基本性质：5’→3’的DNA聚合酶活性;5’→3’的核酸外切酶活性；3’→5’的核酸外切酶活性。 ?基本用途 缺口前移标记法：Nick translation （切口平移）；制备32P标记的探针。