2020核酶的作用方式与研究技术进展.pptVIP

2. 脱氧核酶 (deoxyribozyme ， DRz) 脱氧核酶 DRz 是利用体外分子进化技术获得的一种具有 高效催化活性 和 结构识别能力 的单链 DNA 片段。 DRz 的活 性部位能在原子水平上区分底物，并催化类似反应。所有 的 DRz 都是单链分子，如同单链 RNA 分子一样，能进行折 叠、催化和展现酶活性。通过实验创造的 DRZ 连续被发现 并且催化性能不断提高。 自 1994 年首次发现脱氧核酶以来，迄今已发现的 DRz 有 几十种。根据其功能可分为 7 大类： 1 ．具有 RNA 切割活性； 2 ．具有 DNA 连接酶活性； 3 ．具有卟啉金属化酶和过氧化酶活性； 4 ．具有 DNA 水解活性； 5 ．具有 DNA 激酶活性； 6 ．具有 N2 糖基化酶活性； 7 ．具有 DNA 戴帽活性。 但有类似催化活性的 DRz 在自然界中还没找到。 在所有的 DRz 中，最特别的是 具有 RNA 切割活性的 DRZ ，它能催化 RNA 特定部位的切割反应，从 mRNA 水 平对基因灭活，从而调控蛋白质的表达，可能成为对抗病 毒感染、肿瘤等疾病的新型基因治疗药物和基因功能研究、 核酸突变分析等的新型核酸工具酶。目前发现多种此类 DRz ，最主要的 2 种是 Santoro 等从 1014 个随机序列中通过 体外 PCR 筛选法获得的第 10 轮循环的第 23 个和第 8 轮循环 的第 17 个克隆，分别命名为“ 10- 23 DRz” 和“ 8- 17 DRz” ， 其中对 10-23 DRz 家族的研究最深入。 10-23 型脱氧核酶的结构 8-17 型脱氧核酶的结构 核酶的催化机制 ? 大型核酶的催化机制 ? 小型核酶的催化机制 大型核酶的催化机制 第一类内含子与第二类内含子通过一种 两步反应 来切割 初始转录物，进而将外显子连接起来，产生成熟的 RNA 。 RNase P 是产生 tRNA5 端的核酶，所有的 tRNA5 端都由 它产生。它们的催化反应发生时都伴随有磷酸基团的变构。 第一类内含子的催化机制 第一类内含子的催化过程如下： 第一步，鸟嘌呤单核苷酸的 3 -OH 进攻切割位点的 5 磷 酸，产生游离 的 5 外显子。 这一步只能由鸟嘌呤核苷酸来 催化，但可以是单核苷酸，也可以是二核苷酸或三核苷酸， 这表明此反应不需能量的介入； 第二步，游离的 5 外显子 的 3 -OH 进攻 3 切割位点的磷酸，两个外显子连接起来同 时游离出带有外来鸟嘌呤的内含子。 这两步都是可逆的。 内部引导序列（ IGS ）可以与底物部分配对，进而来定位 切割位点。切割下来的内含子又进一步自身环化，去除一 小段核苷酸，产生内含子核心 L-19 。 第一类内含子的自剪接反应 第二类内含子的催化机制 第二类内含子的催化过程如下：第一步，内含子里面 （与第一类内含子不同）一个保守的腺嘌呤残基的 2 -OH 进攻 5 磷酸，产生 5 游离外显子和由 3 外显子与内含子构 成的中间体；第二步， 5 游离外显子的 3 游离羟基进攻 3 切割位点的磷酸，两个外显子连接起来，并切割下内含子。 RNase P 的催化机制 RNase P 催化所有 tRNA 的 5 末端的形成，但是由于 tRNA 的 5 末端没有保守序列，人们认为 RNase P 是通过识 别底物的三级结构来完成的。其催化反应需要二价阳离子 （如 Mg 2+ 或 Mn 2+ ）和一价阳离子（如 k + 或 NH 4+ ）的共同 参与。其中一价离子在反应中主要用来稳定结构，而二价 离子不仅对于稳定结构，而且对于切割是必需的。在切割 反应中，金属离子活化的氢氧根被用作亲核试剂。 小型核酶的催化机制 锤头型核酶的催化机理 锤头型核酶对切割位点的识别遵守 NHH 规则（ N 代表任 意核苷酸， H 代表 A ， U 或 C ）。它的催化过程需要二价 金属离子（如镁离子）的参与，人们提出两种催化机理： 单金属离子催化和双金属离子催化。 图 5 锤头型核酶两种可能的催化机理 （ a ）单金属离子催化；（ b ）双金属离子催化 。 单金属离子催化机理如图 a ，在这个模型中，金属氢氧化物作为广义碱从 2OH 接受质子。活化的 2 氧作为亲核试剂进攻切割位点的磷酸。双金属离子机 理如图 b 。 A 位点的金属离子作为路易斯酸（ Lewis acid ）接受 2 氧的电子，使 2OH 去质子更容易。 B 位点的金属离子也作为路易斯酸接受 5 氧的电子，使 O-P 键极化且键合力减弱，从而使氧原子更容易游离出来。 HDV 核酶的