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引物设计原则及酶切位点选择和设计 ［整理］:最初的时候，由于害怕设计酶切位点最后且不开，所以经常采用最通用的方法，用 T载体克隆解决问题，但后来发现她也有问题，就是浓度提不上去，你需要体大量的载体来 酶切，所以感到还是直接扩增好一点。 但这就需要你仔细设计引物。 连入质粒中的重要目的 就是进行酶切和连接，当然首先就是在想要合成或者是进行 PCR扩增出靶基因的时候在核 酸的两端接入酶切位点， 酶切位点是与你的质粒的特点相关的， 可以在质粒的图谱说明书上 找取相应的位点，进行设计。 （一） 设计引物前应做的准备工作： 准备载体图谱，大致准备把片断插在那个部分 对片断进行酶切分析，确定一下那些酶切位点不能用 准备一本所买公司的酶的商品目录，便于查酶的各种数据及两种酶是否可以配用 （二） 设计引物所要考虑的问题 两个位点应是载体上的，，所连接片断上没有这两个位点，且距离不能太近， 往往导致两个 酶都切不好。因此，紧挨在一起，只能切一个，除非恰好是与上面两个酶在一起的酶切位点。 我看promega的说明书上说，最好隔四个。 还有一种情况是：不能有碱基的交叉，比如 AGATCTTAAG这样的位点比较难切。 以省钱。 Tm的计算，关于Tm的问题，很多的战友都有疑惑。其实园子里有很多的解释了。 Tm叫溶解温度（melting temperature, Tm），即是DNA双链溶解所需的温度。 大家可