《常规反相分析方法开发的流程》.docxVIP

1 1.回顾样品信息 样品的分子量、pka、酸碱性 流动相需要缓冲盐吗?酸性、碱性化合物需要加缓冲盐来控制流动相pH 流动相需要缓冲盐吗? 样品需要预处理吗? 有损坏色谱柱的、干扰检测的成分则预处理 2.明确分离目标 足够的分离度、最短的分离时间、精确度等 3.展开起始的分 离 色谱柱: 100mm*4.6mm*3um , C18或者 C8 （或者其他大小 和内径） 流速: 2ml/min 柱温: 30 C 或 35 C 流动相：样品不含酸和 碱： 乙腊和水 流动相：样品含酸和碱： 流动相：样品含酸和碱： 乙腊和（pH2.5-3.0 （10-25mmol/l ）缓冲盐 根据样品pka选择流动相的pH （流动相的pH在样品的pka 土 1.5的外），根据流动相 pH选择缓冲液， 尽量选择pka与流动相的pH相等的缓冲盐， 浓度经 常为5-50mmol/l。磷酸盐、乙酸盐、甲酸盐都是在 pH小于8时最常用的缓冲液。 梯度：10分钟内5%~100%B 3.1.遇到的问题: 过早洗脱（说明 样品的极性大， 离子化的酸或 碱） 可以减少起始的 %B或者使用起始梯度停留 改变流动相的pH增强他们的保留（减少分子的离子化） 在流动相中加入离子对试剂 过迟洗脱（样品 的极性很小）H 过迟洗脱（样品 的极性很小） H值，见附件1） 使用正相色谱或者 HILIC 使用亲酯性较弱的色谱柱（降低 使用正相色谱 4优化梯度色保 留因子k 5.优化梯度选择 性 5.1 :加入步骤 的分离度v 2, 者需要增短时间 复杂的样品（样 品大于15种成 分） 如果都是目标化合物，可使用 2D色谱 几个化合物是目标成分：样品先预处理 起始的分离条件对于大多是小分子样品 （分子量V 1000 ） 一般能使k值大约为 5 梯度时间和柱 温是首选。 建议第二个方法将梯度时间延长 2-3倍，在没有分开的情况 下可以进一步延长时间获证增加柱温为 50 C 用甲醇替代乙腊重复步骤 更换色谱柱重复步骤 1-4 1-4 6.调整梯度范围 和形状 6.调整梯度范围 和形状 A:考虑最佳的起始和最终的 %B值，从而在分离度 Rs合理的前提下实现最短的 实验时间 B:对于“较脏的”的样品，加入坡度较大的梯度分段至 至 100%B，维持 3-5min 等） 100%B (例如在 5min C:加入坡度较大的梯度分段来加速色谱图后喘的、 间隔较宽的色谱图峰的洗脱 D:加入的等度度停留从而改善梯度前洗脱出来的色谱峰之间的分离度 7.以步骤5、6中 获得的最佳的分 离效果为基础， 平衡分离度和运 行时间 8.测量连续的阳 阳机那样之间， 色谱柱的必要平 衡时间 附件1 ： 改善色 谱柱的色谱柱的大小、粒径、 条件 流速、样品的分子量运 能影响色谱柱的塔板 数。粒径和色谱柱的大 小通常在方法建立之 前已选好。增长色谱柱 的长度通常能增加塔 板数、分离度、实验时 间。在梯度洗脱中，使 tgF/L保持恒定，从而 使保留因子 K*保持恒 定。 以上面选好的 实验条件开展 连续几次同样 的分离，并同时 改变进样之间 的平衡时间；选 择能给出台理 分离效果的的 最短的平衡时 间 保留因子 K: J ■ - I w] tg:梯度时间；F：流速；Vm：死 体积；？：梯度范围；S:分子量 在100-500Da的样品S值为 4 。 一般使用10个或者以上的色谱柱体积的其实流动相来平衡 色谱柱（约等于 10乘死时间的体积） 费54遇过疏水烽减法H式臬18述柱干的传坯（等式53* ■ L C，■ ■ , /—X— L f—%- / — . . M r x 9 貌酬霆期 ClgH-7 虹 不同幼打芋遂型 K F—一 仁 9削 日诚 g ?II - Li 如燔S!回 09 -^12 乜醺 w 倾 事屈 AU ttCft 电摘 w e 蛙 M 3炳司 AJN 顾 utm g ftm n? 界典 ? O 心懦小 配帼 做 曲 u 螭?麦羽-■ UM 岫 山 ?O1 辿 皿 g -au 书血 正迫 43 金典?睥 0S5 -40 -a? BJ? o? U 4UKME -IW ftM cm g IB 查# 诫 -fW tirw 顼艇 5理 ■郭 函 ifeMm 顾 呻 lift? P.I2 DE ”加 顺 翊区 M? 辿 WM4) ^W09 19 诚 0? 皿 w 制g哄5 9, -(I, 顼善 Mt 神 SSI u 略? tM 项』i 岫. g m 5；7 KW 阿 w Mrr E M 不同。!■%.堂电屋的S桂手* ■M^ 141 w om 4)X0 山” mu fel W 皿 心 皿 网肝占 9JM 呷 ?项暖 顼翌 w Hl L倒 w wm 璋事 Iwri^l I3M^W ”姑 cum -ii 5Jtt? ^11