堆型艾美耳球虫乳酸脱氢酶DNA疫苗免疫保护作用及免疫机理研究.docxVIP

堆型艾美耳球虫乳酸脱氢酶 DNA疫苗免疫保护作用及免疫机理 研究 鸡球虫病是由艾美耳属 (Eimeria) 球虫寄生于鸡肠上皮细胞内所引起的寄生 虫病,分布于世界各地 ,对养禽业危害巨大。 由于目前的药物预防、 活疫苗接种等 防控措施存在较多问题 , 因此,有必要研究新的防控手段。 DNA疫苗可以诱导宿主产生长期的体液免疫和细胞免疫，预防包括球虫病在 内的多种疾病 , 因此成为疫苗发展的新方向。已经有多种球虫保护性抗原如 EtMICs、SO7、5401、cSZ-1、3-1E 等被发现 , 其保护效果也已经被大量的研究所 证实。 研究发现,堆型艾美耳球虫(E. acervulina) 乳酸脱氢酶(LDH)是相对分子质 量为 37 kDa 的蛋白, 在球虫发育的 4个阶段(卵囊、子孢子、裂殖体和裂殖子 ) 均有相似水平的表达 , 可对 E. acervulina 的攻击产生部分保护力 , 被认为是一种 很有潜力的疫苗候选抗原。本研究利用 RT-PCF方法从E. acervulina 第一代裂 殖体克隆了 E. acervulina LDH基因,酶切及PCF鉴定均正确的菌株经测序,结果 显示,克隆片段含一个长993 bp的开放阅读框(ORF),编码330个氨基酸,与 Gen Ba nk上的E. acervuli na LDH 基因序列相似性为 98% 应用DN/重组技术，将LDH基因克隆到原核表达载体pET28a(+)中，转化大肠 杆菌BL21(DE3),通过IPTG诱导表达重组LDH蛋白。SDS-PAG电泳显 示,pET28a(+)-LDH在大肠杆菌中得到成功表达，其分子量在41 kDa左右。 菌体经超声破碎后的沉淀与上清的 SDS-PAG分析结果表明，重组蛋白主要 以包涵体形式存在。本研究利用 DNA重组技术,分别构建pVAX-LDH pVAX-LDH-IFN-丫 和 pVAX-LDH-IL-2 DNA疫苗。 经鉴定正确后 ,分别用重组质粒免疫 14日龄雏鸡 ,1 周后取肌肉注射部位、 非注射部位组织和pVAXI空质粒注射部位,用RT-PCF和western blot 检测疫苗 的转录和表达情况。结果表明，构建的DNA疫苗均能在注射部位肌肉成功转录和 表达。 将构建的 DNA疫苗 pVAX-LDH pVAX-LDH-IFN-丫 和 pVAX-LDH-IL-2 以及 LDH 重组蛋白和包涵体经腿部肌肉分别于 14、21 日龄两次免疫雏鸡 ,并设立感染非免 疫和非感染非免疫对照组,另设pVAXI空质粒注射组。除非感染非免疫组外,28 日龄经口接种新鲜的 E. acervulina 孢子化卵囊 , 攻虫第 6 天宰杀全部实验动物 , 计算存活率、进行病变记分、增重、卵囊下降率,通过计算综合抗球虫指数 (ACI) 这些生理指标 , 评价构建的疫苗对鸡抗球虫保护力。 结果表明 , 所构建的重组质粒对感染球虫鸡均具有一定的保护效果 , 其中以 pVAX-LDH-IFN-丫和pVAX-LDH-IL-2重组质粒组保护效果最好。用构建的3种DNA 疫苗免疫14日龄雏鸡,并设灭菌水注射和pVAX1空质粒对照组。 21 日龄以同样剂量加强免疫一次 , 二免后第 7 天, 取鸡脾脏分离淋巴细胞。 采用MTT法测定脾脏淋巴细胞增殖反应。 结果发现,DNA疫苗免疫后鸡脾脏淋巴细胞增殖水平均显著高于灭菌水和 pVAX1空质粒对照组。说明构建的DNAS苗可以刺激鸡体的免疫系统尤其是细胞 免疫反应。 用构建的3种DNA疫苗免疫14日龄雏鸡，并设灭菌水注射和pVAX1空质粒对 照组,21 日龄以同样剂量加强免疫一次。 分别于首次免疫后第 7天和第 2次免疫 后第7天取鸡脾脏和盲肠扁桃体分离淋巴细胞 ,用带有荧光标记的 CD3+、CD4+、 CD8单克隆抗体进行荧光染色,用流式细胞术检测CD3+ CD4+/CD3+ CD8+/CD3+ 的比例。 结果发现,第1次免疫后第7天脾脏和盲肠扁桃体中各组间 CD3+T淋巴细胞 水平差异均不显著(Pgt;0.05),第2次免疫后第7天,DNA疫苗组CD3水平显著 高于灭菌水和pVAXI空质粒组(Plt;0.05)。结果表明,构建的DNAS苗可以增强 鸡体 T 淋巴细胞反应。 用构建的3种DNA疫苗免疫14日龄雏鸡，并设灭菌水注射和pVAXI空质粒对 照组,21 日龄以同样剂量加强免疫一次。二免后第 7天,取鸡脾脏和盲肠扁桃体 分离淋巴细胞。 提取淋巴细胞总RNA反转录合成cDNA进行实时荧光定量PCR检测脾脏和 盲肠扁桃体中 IFN- 丫、IL-2、IL-4、TNFSF15 IL-17D 和 TGF-B 4mRNA水平变 化,以GAPD为内参照,采用2- △ △ CT方法计算各细胞因子相对 mRNA表达量。结 果发现,疫苗免疫