多靶点pCRISPR载体(单子叶和双子叶植物用)使用方法.docxVIP

CRISPR/Cas9-based genome editing technology A robust CRISPR/Cas9 vector system for multiplex targeting of genomic sites in monocot and dicot plants 亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室华南农业大学生命科学学院刘耀光课题组 ( ygliu@) 1. pYLCRISPR/Cas9多靶点载体介绍 CRISPR/Cas9 是新近发展的基因组编辑技术 (图 1)。CRISPR/Cas9 切割靶序列仅需要 single-guide RNA (sgRNA)以及由 sgRNA引导的 Cas9 蛋白，比锌指核酸酶( ZFNs)，TALENs更加简便，高效，因而成为基因组 编辑工具的首选。 我们利用 CRISPR/Cas9 技术可方便地进行多重靶向的特征，构建了一套用于单子叶和双子叶植物的多 靶点 CRISPR/Cas9 基因打靶载体系统。 本套载体将 Cas9 蛋白表达盒整合到双元载体上，用于装载多个 sgRNA表达盒的多克隆位点 Bsa I 位于 靠近双元载体 RB位置。 sgRNA表达盒元件设在中间质粒载体上，利用酶切连接和 PCR方法拼装好，再利用 Golden Gate 或 Gibson Assembly 克隆方法组装到双元载体上。 RuvC-like domain Cas9 nuclease HNH domain Target Site genomesequence5 NNNNNNNNNNNN GNNNNNNNNNNNNNNNNNNNPAMNNNNNNNNNNNN-3 NGGNNNNNNNNNNNN-3 genomesequence 3 NNNNNNNNNNNN Cleavage site NCCNNNNNNNNNNNN5- NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN 5- G/A NNNNNNNNNNNNNNNNNNNGNUUUUAGAGCUAG AA AACUAUUGCCUGAUCGGAAUAAAAUU CGAUAA GAA UUUUU-3 CUUCGGAUAGAGAACGUUGGCACCGA CUU CGGA UAGAGAACGUUGGCACCGA Figure 1. A working model of the CRISPR/Cas9 system. The Cas9-sgRNA complex locates to the target site to cleave the DNA to produce double strand break (DSB). separated by a shorten form of the separated by a shorten form of the ccdB negative selection gene. 2． CRISPR/Cas9载体与 sgRNA载体图谱 2.1CRISPR/Cas9双元载体 本套载体系统的双元载体骨架为 pCAMBIA-1300 (ACCESSION: AF234296) ，Cas9p 为本实验室设计合成 的植物优化密码子基因，它模拟了禾本科植物基因具有 5端 GC含量较高的特征 (Figure 2) 。 这些质粒在 E. coli TOP10F( LacI q) 菌株繁殖，该菌株 LacI q基因型产生的阻碍蛋白可抑制 ccdB大肠 杆菌致死基因的表达。 pYLCRISPR/Cas9Pubi-H, -B 载体中的 Cas9p用 pUbi 驱动，优选用于单子叶植物的基因打靶；对于双子 叶植物， 目前优先使用 pYLCRISPR/Cas9P35S-H, -N,-B 。我们用 pYLCRISPR/Cas9Pubi-H 在拟南芥也打靶成功， 但与 pYLCRISPR/Cas9P35S-H 对拟南芥的打靶效率比较正在测试中。 我们对 pYLCRISPR/Cas9载体采用了新的命名，与旧的命名对应关系见表 1。 Figure 2. A CRISPR/Cas9 system for monocot and dicot plants. pYLCRISPR/Cas9Pubi-H, -B (above); pYLCRISPR/Cas9P35S-H, -N,-B (below); HPT (-H) , Bar (-B) , and NPT II (-N) encode hygromycin B phosphotransferase, PPTacetyltransferase and neomycin phosphotransferase II, respectively. NLS, nuclear localiz