蒺藜苜蓿细胞分裂素应答调控及IPT基因功能鉴定.pdfVIP

摘要 摘 要 蒺藜苜蓿（Medicago truncatula ）是一种重要的豆科牧草植物，也是研究豆科植 物的模式植物。目前关于植物细胞分裂素的响应应答机制，主要在拟南芥、水稻等传 统模式植物中开展，蒺藜苜蓿对细胞分裂素的响应机制未知；相关研究集中在细胞分 裂素直接诱导方面，关于细胞分裂素抑制剂对植物的影响未知；同时相关研究主要集 中在短期诱导上，关于长期使用细胞分裂素对植物的影响，无相关研究报道。 本研究主要是分析蒺藜苜蓿对细胞分裂素及细胞分裂素抑制剂长期应答机制。通 过使用两种化合物，6-苄氨基嘌呤（6-benzylaminopurine ，6-BA ）与洛伐他汀（lovastatin ） 分别行使细胞分裂素的诱导和抑制作用，对蒺藜苜蓿幼苗进行长时间处理。通过高通 量测序技术，进行差异表达基因筛选和分析；并对1个细胞分裂素合成关键调控基因 IPT进行了深入的功能研究，主要结果如下： 1.对蒺藜苜蓿进行6-BA处理及lovastatin处理，进行高通量测序。共构建了9个测 序文库，测序和数据处理共获得了67.3Gb clean data；经过数据拼装，总共鉴定出33,782 个基因和55,558条转录本，通过进一步分析发现，存在22,407条新转录本以及1,079个 新基因。 2.将实验样品分为两种组合：细胞分裂素处理/对照（cytokinin/control，Cyto/Ctrl ）， 抑制剂/对照（inhibitor/control ，Inh/Ctrl ）。差异表达分析发现：两种组合中分别有3,627 和3,093条差异表达本（differentially expressed transcript ，DET ）；功能注释和植物激 素数据库比对发现：两种组合中存在多条可能涉及植物激素合成、代谢及信号传导的 DET 。 3.利用RT-PCR技术，成功克隆蒺藜苜蓿IPT基因，该基因的编码区全长为900-bp ， 编码300个氨基酸；利用大肠杆菌表达体系，成功表达IPT重组蛋白；通过免疫小白鼠， 成功制备IPT蛋白质多克隆抗体。 4.构建IPT基因植物表达载体，通过农杆菌介导转基因技术，获得转基因紫花苜 蓿；筛选高水平表达转基因植株，表型分析结果显示：转基因植物分枝数增多，植物 衰老推迟；ELISA检测发现：转基因植物中的细胞分裂素水平远远高于未转基因植物； 在持续干旱条件下，转基因植物对干旱抵抗能力明显高于未转基因植物。 对蒺藜苜蓿进行细胞分裂素、细胞分裂素抑制剂长期处理，进行了转录组测序及 I 摘要 分析研究，筛选了一批可能涉及蒺藜苜蓿细胞分裂素应答关键调控基因，初步阐述了 蒺藜苜蓿对细胞分裂素调控及响应机制；并对一个潜在的参与蒺藜苜蓿细胞分裂素合 成调控基因IPT进行了克隆及转基因功能鉴定，证实：该基因参与细胞分裂素生物合 成，高水平表达该基因提高植物对干旱抵抗能力，能够延缓植物的衰老。 本工作为在蒺藜苜蓿中开展细胞分裂素研究提供了丰富的数据；为分析细胞分裂 素对植物的长期效应，提供了理论参考；为深入分析蒺藜苜蓿IPT基因功能奠定了基 础。 关键字：蒺藜苜蓿，细胞分裂素，转录组，IPT 基因 II 目录 目 录 摘 要I ABSTRACT III 目 录 V 主要符号对照表IX 1 引 言 1 2 文献综述 2 2.1 细胞分裂素研究进展 2 2.1.1 细胞分裂素的合成与代谢 2 2.1.2 细胞分裂素的转运 4 2.1.3 细胞分裂素信号转导 4 2.1.4 细胞分裂素的生理功能 5