食品检测实务（王若超） 食品检测实务（王若超） 微生物快速检测技术的发展现状.pptVIP

荧光酶标记原理 ??????????????? ???????????????? ????????????? ??????????????? ???????????????? ????????????? ??????????????? ???????????????? ????????????? 直接单细胞标记 (包括孢子) 细胞无增菌要求 标记在90分钟内完成 直接对活细胞和酵母进行标记 标记的细菌 标记后的酵母 标记后的霉菌 ChemScan RDI 三个简单的步骤 2. 标记 3. 激光扫描 1. 过滤 检测步骤 - TVC 1. 过滤 2. 标记 3. 激光扫描 样品过滤 预标记 60 min 滤膜转移 ChemScanRDI ? 仪器分析 标记 30 min ChemScanò RDI 主机 激光扫描分析仪 3 分钟分析时间 结果直接显示细胞个数 Laser scanning 致病菌快速检测方法 显色培养基法：技术成熟，产品很多。 免疫学方法：产品最多，特异性和敏感性都很高，但有假阳性存在，阳性结果需要确认。通常的原理有EIA，ELISA，GLISA，荧光酶免、免疫磁分离等方法。市场上的产品多，如BioMeriux,Tecra, Neogen,Biocontrol, Matrix等。 分子生物学方法：以基因探针检测法和PCR法为主。 基因芯片：研究热点。 华粤行仪器有限公司 致病微生物快速检测产品 免疫磁分离法— Matrix公司的Pathatrix致病菌快速检测系统 ELISA方法—澳洲TECRA公司的免疫捕获快速检测 华粤行仪器有限公司 分子生物学方法(基因探针及PCR方法) GLISA---胶体金免疫层析致病菌快速检测条 荧光酶免—Vidas系列产品(略) 显色培养基– 法国AES公司 GLISA－胶体金免疫层析检测条 氯金酸(HAuCl4)在还原剂作用下，可聚合成一定大小的金颗粒，形成带负电的疏水胶溶液。由于静电作用而成为稳定的胶体状态，故称胶体金。胶体金标记，实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。 胶体金检测条在临床诊断中广泛使用。方法成熟，使用简便。 关键是制备单克隆抗体，然后与胶体金交联，在亲水纸层析条上固定。 胶体金微生物检测条在国内已经有不少产品，但用户并不多，主要是质量不稳定。 外来的胶体金微生物检测产品比较多。 常见的胶体金检测条举例 大肠杆菌O157 李斯特氏菌 沙门氏菌 胶体金检测条的优缺点 胶体金检测方法属于免疫检测法，检测的是死菌和活菌。 一般需要增菌过夜。 增菌后的检测非常简单，约10分钟一般能完成。 无需专门的检测仪器。 进口的检测条的价格比较高，通常要30－90元。 分子生物学方法 基因探针法及PCR方法在国外已经有相当成熟的表现。 有普通PCR，荧光PCR，实时荧光PCR（定量PCR）等多种方法。 基因探针法一般也需要增菌，然后加探针试剂杂交，然后在荧光显微镜荧光检测器下获得结果。 PCR方法一般不需增菌太长时间，通过PCR方法对待测微生物的特征片断进行扩增，然后通过凝胶电泳或荧光PCR技术判断结果。 分子生物学方法应用前景 试剂盒开发相对比较容易。只要找出特征的基因片断，合成出引物即可。 目前客户比较关注的致病菌，包括沙门氏、李斯特氏、大肠杆菌O157、副溶血弧菌、霍乱弧菌、志贺氏菌等均有PCR试剂盒供应。 分子生物学方法病原菌检测系统的优缺点 分子生物学方法检测致病菌，特异性较强，技术较为前沿，特别是相对国标方面来说。 但国外用户反映其假阳性概率仍然较高，因此只能作为一种初筛方法。 速度方面：仍然需要增菌，一般是第二天出结果，与免疫法比没有速度优势 实验要求 1.分组：每班6组，必须穿实验服。严查出勤率，有事需持假条。 2.实验项目：检验样品中的菌落总数、大肠菌群、金黄色葡萄球菌（第一法） 3.及时书写实验报告。 微生物综合实验一、实验目的：掌握食品中菌落总数、大肠菌群、金黄色葡萄球菌的检验方法。二、主要实验试剂与器材：PCA培养基、LST培养基、7.5%氯化钠肉汤、血平板、氯化钠；显微镜、生化培养箱，超净工作台、电子天平、水浴锅、高压蒸汽灭菌锅；移液管、培养皿、三角瓶、试管、均质袋。三、实验步骤：1.无菌取样25g置于均质袋1，倒入225mL无菌生理盐水（0.85%），均质；领取25g置于均质袋2，倒入225mL 7.5%氯化钠肉汤，均质，培养。2.将均质袋1中稀释液依次做梯度稀释至10-33.选取-1，-2，-3三个连续稀释度各1mL至9mL发酵管中；同时选取这-2，-3稀释度倾注平板，每个稀释度做一个平行样；空白对照2个，倾注平板。4.将上述操作完成后的平板