实验七 真菌DNA的提取.docVIP

实验七：真菌基因组DNA的提取（CTAB法） 实验目的：1.初步掌握DNA的粗提取和鉴定的方法。 2.观察提取出来的DNA物质 实验原理：CTAB法原理 CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中(0.7mol/L NaCl)，CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。通过有机溶剂抽提，去除蛋白，多糖，酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。CTAB提取缓冲液的经典配方Tris-HCl (pH8.0)提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl 提供一个高盐环境，使DNP(2,4-二硝基苯酚)充分溶解，在于液相中； CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除氯仿：加速有机相与液相分层。异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。异丙醇：沉淀DNA。最后用两个梯度酒精冲洗DNA。 实验材料和仪器用具： 材料：板栗疫病病原菌（Cryphonectria parasitica子囊菌亚门、核菌纲、球壳目、间座壳科、内座壳属的栗疫菌） 仪器和试剂：离心机、微量移液器、水浴锅、冰箱、石英砂、CTAB、β-巯基乙醇、氯仿/异戊醇（24：1）、异丙醇、70%酒精、95%酒精 试验方法和步骤： （1）在超净工作台上刮取2mg菌丝于滤纸，吹干，装于灭菌的离心管中； （2）加入500ul经65℃水浴充分溶解的CTAB、2ulβ-巯基乙醇充分混匀； （3）加入石英砂用研磨棒充分研磨； （4）置于65℃水浴锅中水浴一小时，每十分钟颠倒摇匀一次； （5）加入500ul氯仿/异戊醇（24：1），颠倒混匀； （6）室温下，11000rpm离心10min； （7）取上清液，加入0.5×V上清液异丙醇，颠倒混匀； （8）-20℃保存2.5h （9）将离心管从-20℃取出室温12000rpm离心10min； （11）弃去上清，加入70%乙醇750ul，12000rpm离心1min； （12）弃去上清，加入95%乙醇750ul，12000rpm离心1min弃去上清； （13）在超净工作台中吹干。 作业：描述提取的DNA形态