PCR关键技术综述专业资料.docVIP

PCR技术综述 摘要：PCR（polymerase chain reaction）即聚合酶链式反应，是一个经过体外酶促合成，扩增特定DNA片段方法。本文关键针对PCR概念，原理和方法，简明介绍常见PCR相关技术及其原理，方法及应用。 关键词：PCR；原理；应用及展望 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction），简称PCR，又称无细胞分子克隆系统或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增法，是体外酶促合成特异DNA片段一个方法，由变性、退火及延伸等反应组成一个周期，可循环进行，使目标DNA得以快速扩增，含有高特异性、高度灵敏性、高丰产量等特点，此方法在分子生物学、微生物学、医学及遗传学等多领域全部被广泛应用。 1、 PCR技术发展史 上个世纪60年代末，大家开始致力于基因体外分离技术研究，但因为核酸含量较少，大大限制了DNA体外操作。Khorana在1971年最早提出了核酸体外扩增设想，DNA经变性以后和适宜引物杂交，再用DNA聚合酶延伸引物，不停反复该过程就能够克隆出tRNA基因。不过，因为当初基因序列分析方法不是很成熟，热稳定性较强DNA聚合酶也还没有发觉，相关引物合成处于手工合成阶段，所以这种想法没有什么实际意义。 1985年，美国科学家Kary Mullis在高速路启发下，经过两年努力，发明了PCR技术，并在Science杂志上发表了相关PCR技术第一篇学术论文。其原理类似于DNA体内复制，只是在试管中给DNA体外合成提供了适宜条件——模板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶和适宜缓冲体系。自此，PCR技术得到了生命科学界一致认可，Kary Mullis也所以取得了1993年诺贝尔化学奖。然而，最开始PCR技术还很不成熟，在那个时候是一个操作复杂、成本高昂试验室技术。直到Saiki等人从一个嗜热杆菌提取到一个耐热DNA聚合酶，才使得PCR扩增效率得以提升，PCR技术也开始得到广泛应用，成为遗传和分子生物学分析根本基石。在以后几十年里，PCR方法被不停改善：从定性发展到定量；从原先只能扩增多个kb到现在已能扩增几十个kbDNA片段。到现在为止，PCR技术已经有十多个之多。 2、PCR技术原理 基础PCR条件：1、DNA模板(Template)，2、引物(Primers)，3、DNA聚合酶(Polymearse)，4、合成原料及水。 PCR反应包含三个关键步骤，分别是：Denaturation、Annealing，and Extension。Denaturing立即DNA加热变性转为单链DNA作为复制模板；而Annealing则是令引物于一定温度下附着于模板DNA两端，最终在DNA聚合酶作用下进行引物延长(Extension of primers)及另一条链合成。 PCR反应步骤简单，不过具体操作复杂，如退火温度确实定、延伸时间长短和循环数等等。所以，不一样反应体系应该确定合适反应条件，避免假阴性或假阳性等情况产生。 3、PCR技术分类 3．1 实时荧光定量PCR技术（real-time PCR） 学者经研究在1996年首创了实时荧光PCR技术，现已应用于医学、分子生物学和其它基础研究领域。该技术基于传统技术优势，同时含有实时性、正确性、无污染，还实现了自动化操作和多重反应，是PCR技术研究史上从定性到定量飞跃。 荧光定量PCR技术最大特点是将荧光基团加入到PCR反应体系中，借助荧光信号累积，实时监测整个PCR进程，最终经过标准曲线对未知样品进行定量分析。一个PCR循环反应结束以后，定量PCR仪就能够搜集一个荧光信号，荧光信号强度改变能够反应产物量改变，这么就能够得到一条荧光扩增曲线。 3．2 多重PCR技术（mutiplex PCR） 多重PCR技术，即在同一管中加入多对特异性引物，和管内多个模板反应，可同时检测多个目标DNA。多重PCR能够扩增一个物种一个片段，也能够同时扩增多个物种不一样片段[14]。 在同一反应体系中，进行多个位点特异性扩增时，引物之间配对和引物间竞争性扩增等全部会对扩增产生影响。若能选择适宜反应体系和反应条件，就可极大地提升多重PCR扩增效果，比如退火温度、退火及延伸时间、PCR缓冲液成份、dNTP用量、引物及模板量等。 3．3 单分子PCR技术（SM-PCR） 单分子PCR技术和传统PCR技术相比，其基础循环过程是一样，但在反应条件、模板数量、DNA聚合酶选择和引物设计方面有不一样，是以少许或单个DNA分子为模板PCR。 在单分子PCR技术反应中，DNA模板浓度极低，这就要求模板有较高质量，这也是试验成败决定性原因。在设计引物时，应严格控制Gc含量和Tm值，同时尽可能避免引物间存在可配对序列。（在反应混合物模板数极低情况下，若引物之间存在少许配对序列，扩增时极易形成二聚体，使反