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Primer 3 在线引物设计攻略 开始之前：其实非常简单， 不需要你下载任何软件， 但是你得有一台电脑能上网。 当然，最重要的是，你要很清楚用于做引物的模板序列，至于怎么找模板序列， 不再本次讨论范围。另外，要先对 PCF目的序列的长度有个大致估计，好了，马 上开始吧： 第一步：找到 Primer3 的站点。 你不用记住这个站点，但是要记住“ Primer3 这个词，然后打开GOOGL首页，输入Primer3，跳出来的第一个项目就是了 “Primer3 Input 0.4.0 ”，网址是 / 。 第二步：贴上模板序列。 进入 Primer3 站点，可以看到一个引物设计的界面。 （如 下图）在“ Paste source sequence below （5 -3, ”下面的大空框里面把你 的模板序列粘帖进去。注意是 5-3 方向的，数字或者空格都没关系，软件会 自动过滤的。 第三步：重要参数设定。 首先是“ Product Size Ranges ”，如果你不希望软件 给你随便做的话，首先要调整的就是这个参数。默认的参数实际上是从 100 到 1000，这个你得自己改， 如果你希望产物的大小符合你的预期， 尽可能把范围改 小，比如 480-500，具体看情况调整。第二个参数是“ Primer Size ”，默认值 一般可以用，但是，当你用熟了这个软件，你自己就知道该怎么改了。第三个参 数是“ Primer Tm ”这个和 Primer Size 差不多。 第四步： P i ck primers ： 点一下这个按钮， 符合你大小预期的 primer 就出来了， 看看 Primer3 Output 的界面， 多么漂亮！你要的 primer 出来了， 而且有 primer 在序列上的位置比对图，还要 primer本身的信息，包括位置，长度，Tm，GC含 量，任何位置互补碱基数， 3 端互补碱基数，以及引物序列， （注意，下游引物 是 5-3 ），还要产物大小，两引物间任意互补碱基数，两引物间 3 端互补碱 基数等。如果引物尚在参数设定的范围内，但还不是最佳，将会给出警告。 比如（随便举例，本人在做一个超长引物）： WARNING: Left primer is unacceptable: High 3 stability OLIGO start len tm gc% any 3 seq LEFT PRIMER 1 33 69.02 45.45 6.00 1.00 TAATACGACT CACTATAGGGGTGAAAGACTGCC RIGHT PRIMER 1388 34 67.86 29.41 6.00 2.00 AAAGGGTTAATTTG CATGCTTTATTTACACACAT SEQUENCE SIZE: 1388 INCLUDED REGION SIZE: 1388 PRODUCT SIZE: 1388, PAIR ANY COMPL: 5.00, PAIR 3 COMPL: 3.00 第五步：引物设计检验： 可以仅仅设计一对引物，只要在 Pick left primer 或 者Pick right primer 前面的勾勾掉一个就可以。也可以自己定义引物，放在 Primer框里，（注意，下游引物的书写反向仍然是 5-3）如果符合设定的条 件，软件将对给出引物评分，同时给出警告信息，根据警告信息可以适当对自定 义引物做些调整即可，警告信息也让你做实验的时候心中有数。 对于文献发表的 引物，最好都要检查一下，这样就可以避免被别人有意无意误导。至于 RT-PCR 所用的引物，最好是使得产物跨过内含子，这样避免潜在DNA寸RT-PCF的干扰。 实际做引物的时候，要把内含子都去掉，仅仅把外显子序列放入源序列框中， 并 且通过自定义引物设计的方法，使上下游引物分别全部或者部分落在不同外显子 上。至于如何快速识别内含子和外显子以及电子 PCR将另做说明。 1Timer.?至于设计出来的引物的实际效果，根据我的经验，一般情况下都能做到PCF一次 成功，也许随便那一段序列做引物也能达到很好的效果， 但是不管怎么说，软件 做引物可以让自己心中有数。最后， 1Timer.? 3 珅虽11 HPpr □ * iJ 购 Hhi f 佯利■屈ui-rlf 理負 rm| * h ii*!W Wafliw- .八1 ffp1 「■ taaa J 匸二、# ?* F - ■… fi n ■ ■■ .■~ rT rli J * Qs *t * * * i|B. 屆訂UM liLi ■? MBadtri 如]i I占i1 nT ? W Fi if WmdfaWw f jcd^njB i|^ i iriT 匕 7 Z -： Fi:i T |m t-