亲和配基Reactive Blue4与蛋白质的相互作用与吸附研究.pdf

摘要 摘 要 随着生物产业的快速发展，下游分离技术逐渐成为生物制品生产的瓶颈。作 为具有良好特异性的分离技术之一，亲和色谱已在多种蛋白制品，特别是在抗体 的分离中取得成功。其中以染料分子为配基，特别是以三嗪基染料分子为仿生配 基的亲和色谱已成为该领域的研究热点之一。尽管越来越多的三嗪基染料分子作 为亲和配基在蛋白色谱应用中取得成功，但是对于这类配基分子的研究主要集中 在新型色谱介质的制备和色谱方法的建立方面，而对于它们与目标蛋白质之间的 相互作用的研究较少，这极大地限制了三嗪基染料配基的进一步应用以及新型配 基分子的设计。 因此，为了明确三嗪基染料配基与蛋白质之间相互作用的分子机制，本研究 Reactive Blue 4 RB-4 基于前期筛选结果，选择三嗪基染料分子 （ ）作为亲和配 基，通过光谱学手段研究了RB-4 与蛋白质之间的相互作用，并通过RB-4 官能 化的琼脂糖凝胶介质进一步确定了RB-4 对蛋白质的吸附过程，为以RB-4 作为 亲和配基的亲和色谱方法提供了理论支持。本研究获得以下主要结论： （1）通过紫外吸收光谱和内源荧光光谱证明RB-4 与牛血清白蛋白 （BSA）以及菠萝蛋白酶通过静态猝灭机制形成稳定复合物，该结合过程是自 RB-4 BSA 发、放热过程，低温有利于两者之间的结合； 与 和菠萝蛋白酶之间的 结合位点数分别为约2 和约 1，结合位点数随环境条件变化不大，表明RB-4 与 BSA 和菠萝蛋白酶之间具有较强的相互作用；K 随pH 值的变化规律与蛋白质 A 的等电点有关，初步判断RB-4 与蛋白质的相互作用以疏水相互作用为主，且能 够与带正电荷的蛋白质分子发生静电相互作用；同步荧光光谱和三维荧光光谱结 果表明RB-4 与BSA 和菠萝蛋白酶的结合导致BSA 的三级结构破坏，空间结构 变得松散，从而使酪氨酸残基和色氨酸残基周围微环境的疏水性增强。通过RB- 4 与BSA 分子对接实验进一步表明RB-4 与BSA 之间的主要作用力类型为疏水 相互作用 （主要作用氨基酸位点为Phe-567、Ala-568、Ala-510、Val-575、Pro- 572 Phe-508 和 ），同时还存在一定的静电作用与氢键作用。 （2）通过静态吸附实验表明两种RB-4 官能化的色谱介质：常规亲和色谱介 质RB-4-Sepharose 4B和接枝型亲和色谱介质RB-4-Dextran-Sepharose 4B对BSA的 吸附过程是放热反应，高温不利于吸附；吸附过程符合Langmiur模型，主要作用 力为疏水相互作用；通过提高配基密度，可以显著提高介质对BSA的吸附量；在 相同条件下，接枝型亲和色谱介质RB-4-Dextran-Sepharose 4B的吸附量优于常规 RB-4-Sepharose 4B RB-4-Sepharose 4B RB- 亲和色谱介质 ；吸附动力学实验表明 和 I 摘要 4-Dextran-Sepharose 4B两者对BSA的吸附速率均较快，但接枝型亲和色谱介质 RB-4-Dextran-Sepharose4B的吸附速率相对更快。 关 键 词：ReactiveBlue4；相互作用；光谱学分析；接枝型亲和色谱；吸附 论文类型：应用基础研究 选题来源：国家自然科学基金项目 II