重组酶介导的核酸快速扩增法复习课程.pdfVIP

重组酶介导的核酸快速扩增法 摘 要 ：体外核酸快速扩增技术是一种可使微量核酸在体外高效快速扩增的技 术。重组酶介导的扩增 (recombinase-aid amplification,RAA) 技术是在现有体 外核酸扩增原理的基础上发展起来的恒温体外快速扩增核酸技术。 RAA法利用重 组酶、单链结合蛋白和 DNA聚合酶代替了传统 PCR 的热循环解链过程 , 实现了在 37℃恒温下的核酸快速扩增，有望在不远的将来取代传统的热循环 PCR反应。 Abstract Nucleic acid amplification is a biotechnology that trace nucleic acid can be : rapidly amplified in vitro . Recombinase-aid amplification (RAA) is the most recent isothermal amplification technology, in which the classical thermal stable enzyme has been replaced by recombinase,single-stranded DNA binding (SSB) and DNA polymerase. Therefore, the RAA reaction can be carried out at optimized37C or under ° the room temperatures without any heating assistance. These merits could largely facilitate RAA more applicable than PCR in the near future. 关键词： 重组酶 体外核酸扩增 在过去１０年中，若干恒温核酸扩增技术得到快速发展 [1] ，如 SDA技术、 TM A 技术、 HDA技术、 LAMP技术和 RPA／RAA技术等。 本文介绍的重组酶介导扩增 (r ecombinase-aid amplification,RAA) 技术是一种在恒温下可以使核酸快速扩增的方 法。 与 RPA 不同的是 , RAA 扩增法使用的是从细菌或真菌中获得的重组酶 [2] 。 在 37℃恒温下 , 该重组酶可与引物 DNA 紧密结合 , 形成酶和引物的聚合体，当 引物在模板 DNA 上搜索到与之完全互补的序列时，在单链 DNA 结合蛋白 (singl estrandedDNA binding, SSB)的帮助下， 使模板 DNA 解链， 并在 DNA 聚合酶的 作用下，形成新的 DNA 互补链。反应产物也是以指数级增长，通常在 1 h 内即 能得到可以用琼脂糖凝胶电泳检测到的扩增片段 [3] ，整个反应简单快速，因为不 需要高温循环，所以特别适合在有大量样品的非实验室检测场所使用。 1 材料与方法 1.1 蛋白和 DNA 天蓝色链霉菌重组酶蛋白 (SC-recA)和枯草芽孢杆菌重组酶蛋 (BS-recA) 分别 来自天蓝色链霉菌和枯草芽孢杆菌 .将天蓝色链霉菌、 枯草芽孢杆菌重组酶基因分 别克隆至 pET21a表达载体中， 过量表达后用 Ni-NTA 亲和层析纯化， 并用 Bradfo- rd 法定量。重组 DNA 是rnd 基因编码区的一部分 (310 bp)，将此片段连接到载 体上， 转化大肠杆菌获得含重组 DNA 的菌株(Top10) 。 1.2 RAA 扩增 将含有目的片段的大肠杆菌 Top10 菌株过夜培养，从中取出 1 mL 菌液， 100℃