SAG--8_9_10_12参与地克珠利抗鸡柔嫩艾美耳球虫机制研究.pdfVIP

摘要 摘 要 鸡球虫病是由艾美耳属球虫寄生于鸡肠道所引起的一种寄生原虫病，在世界 范围内广泛存在，对养禽业造成巨大的经济损伤。其中柔嫩艾美耳球虫 （Eimeria tenella ）是致病性最强、危害性最大的球虫之一，感染可导致病鸡食 欲减退、营养不良、体重下降、贫血、便血、甚至造成死亡。E. tenella 生活史 复杂，包括内源性生殖和外源性生殖两个阶段，在内源性生殖阶段，E. tenella 作为一种胞内专性寄生虫，必须入侵盲肠上皮细胞才能完成完成的生活史，大量 的裂殖子在宿主细胞内释放并入侵新的宿主细胞，给盲肠组织造成了严重的侵袭 性损伤。目前球虫病的防治策略主要依靠化学药物。然而，药物的长期使用导致 寄生虫耐药虫株的产生。因此，迫切需要寻求新的抗球虫策略。地克珠利 （Diclazuril ）是一种苯乙腈类抗球虫药，对 E. tenella 无性和有性生殖阶段均有 抑制作用。筛选地克珠利抗 E. tenella 的确切作用靶点，将为抗球虫新药的开发 提供依据。课题组前期构建了地克珠利抗 E. tenella 第二代裂殖子差异表达谱 cDNA 文库，通过第二代高通量测序技术筛选获得了 E. tenella 表面抗原 SAG8、SAG9、SAG10 和 SAG12 基因存在高丰度差异表达。本研究通过复制地 克珠利抗E. tenella 感染鸡动物模型，研究地克珠利对E. tenella 第二代裂殖子表 面抗原 SAG8 、SAG9 、SAG10 和 SAG12 表达的影响，为阐明地克珠利抗 E. tenella 入侵作用的分子机理，筛选药物作用靶点，研制新型抗球虫药物提供理论 依据。具体内容如下： （1）E. tenella SAG8、SAG9、SAG10 和SAG12 基因的克隆及序列分析 根据GenBank 公布的E. tenella SAG8、SAG9、SAG10 和SAG12 基因序列 设计特异性引物，PCR 扩增不含信号肽的E. tenella 第二代裂殖子表面抗原基因 的编码序列。构建 pMD19-SAG8 、pMD19-SAG9 、pMD19-SAG10 和 pMD19- SAG12 重组质粒，并转化感受态细胞DH5α，测序鉴定。生物信息学分析表明， SAG8、SAG9、SAG10 和SAG12 具备E. tenella SAGs 家族基因特征氨基酸结构 特征，N 端和C 端具有较强的疏水性、具有GPI 锚定位点及多个抗原表位。 （2 ）SAG8、SAG9、SAG10 和SAG12 多克隆抗体的制备及反应原性检测 将构建成功的 pET-32a-SAG8、pET-32a-SAG9、pET-32a-SAG10 和pET-32a- SAG12 转化表达菌株Rosetta （DE3 ）中，经IPTG 诱导，除 SAG8 外，SAG9、 SAG10 和SAG12 基因均在Rosetta （DE3 ）中诱导表达，且均为可溶性表达，纯 化获得了纯度较高的融合蛋白。将纯化的 SAG9、SAG10 和 SAG12 重组融合蛋 白免疫BALB/c 小鼠，分别制备鼠抗 SAG9、SAG10 和 SAG12 多克隆抗体，间 I 摘要 接ELISA 检测多克隆抗体的效价，结果显示多克隆抗体效价合格。 以E. tenella 孢子化卵囊免疫正常鸡，制备鸡抗E. tenella 血清，以纯化蛋白 为抗原，以鸡抗血清为一抗，山羊抗鸡 IgG 为二抗，Western blot 分析显示 S