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荧光分光光度法测定荧光素钠的含量
一、实验目的
1.学习荧光分光光度法测定荧光素钠的分析原理。
2.掌握荧光分光光度计的操作技术和测定荧光素钠的方法。
二、实验原理
荧光分析法，是以溶液中物质分子对光的选择性吸收为基础而建立起来的一类分析方法。
常温下，处于基态的分子吸收一定的紫外可见光的辐射能成为激发态分子，激发态分子通过无辐射跃迁至第一激发态的最低振动能级，再以辐射跃迁的形式回到基态，发出比吸收光波长长的光而产生荧光。
在稀溶液中，荧光强度IF与物质的浓度c有以下的关系：
当实验条件一定时，荧光强度与荧光物质的浓度成线性关系：
这是荧光光谱法定量分析的理论依据。
三、仪器及试剂
1．仪器
960荧光分光光度计；
LC-UV紫外检测器；
微量进样器
2．试剂
① 二氯荧光素（分析纯）；
② 荧光素钠
四、操作步骤
1.标准溶液配制
准确称取0.05g二氯荧光素标样，配制成2500ml溶液，则此溶液浓度为0.05μm/mL，分别移取此溶液2.0ml、4.0ml、6.0ml、8.0ml，于25ml容量瓶中，并用蒸馏水稀释至刻度，摇匀后，待测定各标准溶液的荧光强度。
2.荧光强度测定
(1)荧光光度计操作
开启220V稳压电源至220V；
打开主机电源开关。
检查氙灯电是否开启。
(2)二氯荧光素发光谱的绘制，参数设置如下：
①设定纵坐标
②设定灵敏度；
③设定扫描速度；
④发射波长EMISSION Wavelength 250.0 nm；
⑤激发波长范围200-350 nm；
⑥将某一浓度的二氯荧光素标液置于试样池中；
⑦扫描得到激发光谱。
(3)标准溶液及样品的测定，参数设置如下：
①设定纵坐标
②设定灵敏度；
③设定扫描速度；
④设定激发波长EXCITION Wavelength 496.0nm(从激发光谱曲线中)得到；
⑤发射波长范围EMISSION Wavelength 518nm；
⑥将1号标准溶液放入试样池中；
⑦扫描得到荧光光谱。
仪器开始扫描，得到1号标准溶液的荧光强度。其余4各标准溶液和样品液只要重复上述⑥⑦操作，就可以分别得到它们的荧光光谱。按各标液的荧光强度做出I-C工作曲线。
五、数据记录及计算
1.列表
样品编号
样品浓度(μm/mL)
荧光强度（IF）
1
0.02
58.7
2
0.04
98.7
3
0.06
128.35
4
0.08
165.3
5
0.10
201.8
6
样品
108.75
2.工作曲线的绘制
未知样品荧光强度为108.57， 由线性拟合方程Y = 1764 X + 24.73 可知待测样品浓度为 0.06μg/mL
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