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第六章 核酸的分离与纯化 第一节 核酸分离与纯化的设计与原则 细胞内的核酸包括 DNA 与 RNA 两种分子，均与蛋白质结合成核蛋白 nucleoprotein）。DNA 与蛋白质结合成脱氧核糖核蛋白 （ deoxyribonucleoprotein， DNP），RNA 与蛋白质结合成核糖核蛋白（ ribonucleoprotein，RNP）。其中真核生物的 DNA 又有染色体 DNA 与细胞器 DNA 之分。前者位于细胞核内，约占 95%，为双链线性分子；后者存在于线粒体或叶绿体等细胞器内，约占 5%，为 双链环状分子。除此之外，在原核生物中还有双链环状的质粒 DNA ；在非细胞 型的病毒颗粒内， DNA 的存在形式多种多样，有双链环状、单链环状、双链线 状和单链线状之分。 DNA 分子的总长度在不同生物间差异很大，一般随生物的进化程度而增长。如人的 DNA 大约由 3.0 ×109 个碱基对（ base pair, bp）组成， 与 5 243bp 的猿猴病毒（simian virus 40, SV40）相比，其长度约为后者的 5.7 ×105 倍。相对来讲， RNA 分子比 DNA 分子要小得多。 由于 RNA 的功能是多样性的， RNA 的种类、大小和结构都较 DNA 多样化。DNA 与 RNA 性质上的差异决定了两者的最适分离与纯化的条件是不一样的。 一、材料与方法的选择 （一）材料与方法的选择 临床常见的标本有血液、尿液、唾液、组织及培养细胞等；核酸分离与纯化的方法非常多， 如何恰当地收集与准备材料， 选择适宜的分离与纯化方法是一个首要的问题。 首先我们应当明确核酸的分离与纯化并不是最终的目的， 不同的实验研究与应用对核酸的产量、完整性、 纯度和浓度可能有不同的要求； 至于分离与纯化核酸所需的时间与成本也往往需要考虑； 在不影响核酸质量的情况下， 应选择安全无毒的试剂与方案。近年来，有关试剂盒的开发与自动化仪器的使用，能批量制备核酸样品，大大提高了分离与纯化的效率。 （二）选择的原则 核酸分离与纯化的方法很多， 应根据具体生物材料的性质与起始量、 待分离核酸的性质与用途而采取不同的方案。无论采取何种方法，都应遵循总的原则：一是保证核酸一级结构的完整性， 因为完整的一级结构是核酸结构和功能研究的 最基本的要求；二是尽量排除其它分子的污染， 保证核酸样品的纯度， 这是本章讨论的主要内容。 （三）核酸完整性的保持 为了保证核酸的完整性， 在操作过程中， 首先应尽量避免各种有害因素对核酸的破坏。影响核酸完整性的因素很多，包括物理、化学与生物学的因素，其中 有些是可以避免的。如过酸或过碱， 对核酸链中的磷酸二酯键有破坏作用， 在核酸的提取过程中，采用适宜的缓冲液，始终控制 pH 在 4～ 10 之间，就可以很好地避免其危害； 另外如高温加热， 除高温本身对核酸分子中的化学键的破坏作用 外，还可能因煮沸带来液体剪切力，因此核酸提取常常在 0～4℃的条件下进行。 其次对无法避免的有害因素， 应采取多种措施， 尽量减轻各种有害因素对核酸的破坏。应尽量简化分离纯化的步骤， 缩短提取的时间， 减轻各种有害因素对核酸完整性的破坏； DNA 酶（ DNase 或 DNAase）的激活需要 Mg2+、Ca2+等二价金属离子，若使用 EDTA 、柠檬酸盐并在低温条件下操作，基本上就可以抑制 DNA 酶的活性。 RNA 酶（ RNase 或 RNAase）的广泛存在与不易失活的特点，决定了生物降解是 RNA 提取过程中的主要危害因素。 二、技术路线的设计 （一）核酸的释放 正常情况下，无论是 DNA 还是 RNA 均位于细胞内，因此核酸分离与纯化的第一步就是破碎细胞、释放核酸。 细胞的破碎方法非常多， 包括机械法与非机械法两大类。 机械法又可分为液体剪切法与固体剪切法。 机械剪切作用的主要危害对象是高分子量的线性 DNA 分子，因此该类方法不适合于染色体 DNA 的分离与纯化。非机械法可分为干燥法与溶胞法，目前，大多采用溶胞法。其中采用 适宜的化学试剂与酶裂解细胞的溶胞法因裂解效率高， 方法温和，能保证较高的得率与较好地保持核酸的完整性而得到了广泛的应用。 （二）核酸的分离与纯化 细胞裂解物是含核酸分子的复杂混合物， 核酸分子本身可能仍与蛋白质结合在一起。在保证核酸分子完整性的前提下， 要从中分离出一定量的、 符合纯度要求的核酸分子， 并不是一件很容易的事情， 这需要我们在对核酸分子有关性质的充分认识的基础上， 利用核酸与其它物质在一个或多个性质上的差异而设计有效 方案加以分离。这种差异是多方面的， 包括细胞定位与组织分布上的差异、 物理化学性质上的不同以及各自独特的生物学特性。 应该去除的污染物主要包括三个部分：即非核酸的大分子污染物