刘耀光_多靶点pCRISPR载体(单子叶和双子叶植物用)使用方法2015-4-14(new)(1).pdfVIP

CRISPR/Cas9-based genome editing technology A robust CRISPR/Cas9 vector system for multiplex targeting of genomic sites in monocot and dicot plants 亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室 华南农业大学生命科学学院 刘耀光课题组 () 1. pYLCRISPR/Cas9 多靶点载体介绍 CRISPR/Cas9 是新近发展的基因组编辑技术 （图1）。CRISPR/Cas9 切割靶序列仅需要 single-guide RNA (sgRNA) 以及由 sgRNA 引导的 Cas9 蛋白，比锌指核酸酶（ ZFNs ），TALENs 更加简便，高效，因而成为基 因组编辑工具的首选。 我们利用 CRISPR/Cas9 技术可方便地进行多重靶向的特征，构建了一套用于单子叶和双子叶植物的多 靶点 CRISPR/Cas9 基因打靶载体系统。 本套载体将 Cas9 蛋白表达盒整合到双元载体上， 用于装载多个 sgRNA 表达盒的多克隆位点 Bsa I 位于 靠近双元载体 RB 位置。 sgRNA 表达盒元件设在中间质粒载体上，利用酶切连接和 PCR 方法拼装好，再利 用 Golden Gate 或 Gibson Assembly 克隆方法组装到双元载体上。 Figure 1. A working model of the CRISPR/Cas9 system. The Cas9-sgRNA complex locates to the target site to cleave the DNA to produce double strand break (DSB). 2．CRISPR/Cas9 载体与 sgRNA 载体图谱 2.1CRISPR/Cas9双元载体 本套载体系统的双元载体骨架为 pCAMBIA-1300 (ACCESSION: AF234296) ，Cas9p 为本实验室设计合 成的植物优化密码子基因，它模拟了禾本科植物基因具有 5’端 GC 含量较高的特征 (Figure 2) 。 这些质粒在 E. coli TOP10F’(LacI q) 菌株繁殖，该菌株 LacI q 基因型产生的阻碍蛋白可抑制 ccdB 大肠杆 菌致死基因的表达。 pYLCRISPR/Cas9Pubi-H, -B 载体中的 Cas9p 用 pUbi 驱动， 优选用于单子叶植物的基因打靶； 对于双子 叶植物，目前优先使用 pYLCRISPR/Cas9P 35S-H, -N,-B 。我们用 pYLCRISPR/Cas9Pubi-H 在拟南芥也打靶成 功，但与 pYLCRISPR/Cas9P 35S-H 对拟南芥的打靶效率比较正在测试中。 我们对 pYLCRISPR/Cas9 载体采用了新的命名，与旧的命名对应关系见表 1。 Figure 2. A CRISPR/Cas9 system for monocot and dicot plants. pYLCRISPR/Cas9Pubi-H, -B (above); pYLCRISPR/Cas9P 35S-H, -N,-B (belo