兽用生物制品外源支原体检验相关试剂的配制、PCR引物和相关培养基.pdfVIP

GB/T ××××—×××× 附录A （资料性附录） 相关试剂的配制 A.1 1 mol/L 三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液 （Tris ·C l，pH 8.0） 称取 121.1 g 三羟甲基氨基甲烷（Tris ）溶解于 800 mL 水中，用盐酸调 pH 至 8.0，加超纯水 定容至 1 L 。在 103.4 kPa （121 ℃）条件下灭菌20 min 。 A.2 平衡酚 取出固体酚，使其温度升至室温，然后在 68 ℃使酚溶解，加入羟基喹啉至终浓度为 0.1 %。 加入等体积的 0.1 mol/L Tris·Cl （pH 8.0），用磁力搅拌 15 分钟，待两相分开后，要尽可能彻 底地移出上层水相液。加等体积的 0.1mol/L Tris·Cl （pH 8.0）到酚中，搅拌 15 分钟，然后按 步骤 2 所述移出水相液。重复抽提，直到酚相 pH 值大于 7.8。酚达平衡后，加入 1/10体积含有 0.2 % 巯基乙醇的 0.1 mol/L Tris·Cl （pH 8.0）。在4 ℃避光保存一个月。 A.3 苯酚:氯仿:异戊醇 （25:24 :1,v/v） 取平衡酚 25 mL，加入 24 mL 氯仿、1 mL 异戊醇后混匀，加入 1/10体积含有 0.2 % 巯基乙 醇的 0.1 mol/L Tris·Cl （pH 8.0）覆盖。 A.4 50 ×TAE 缓冲液 A.4.1 0.5 mol/L 乙二胺四乙酸二钠（EDTA）溶液（pH 8.0） 取 EDAT 18.61 g 溶于 80 mL 双蒸水中，完全溶解后，用氢氧化钠调 pH 至 8.0，定容至 100 mL。 A.4.2 50 ×TAE 缓冲液的配制的配制 取 700 mL 双蒸水，分别加入羟基甲基氨基甲烷（Tris）242 g、冰醋酸 57.1 mL 和 100 mL 0.5 mol/L 乙二胺四乙酸二钠（EDTA）溶液（pH 8.0），充分溶解后，定容至 1000 mL。 A.5 TE 缓冲液（pH 8.0） 分别量取 10 mL 1 mol/L Tris·Cl （pH 8.0 ）和 2 mL 0.5 mol/L EDTA （pH 8.0 ），加超纯水定容至 1000 mL 。在 103.4 kPa （121 ℃）条件下灭菌20 min 。 A.6 1.0%琼脂糖凝胶的配制 琼脂糖 1.0 g 溶于 0.5×TAE 缓冲液 100mL，置微波炉中加热至完全溶解后，冷却至50～60 ℃， 1 GB/T ××××— ×××× 加入溴化乙锭（EB）溶液或Goldview 核酸染料 5 μL，摇匀后倒入电泳板，凝固后取下梳子，备 用。 A.7 加样缓冲液（6×） 称取 250.0 mg 溴酚蓝，加 10 mL 水，在室温下溶解 12 h；称取 250.0 mg 二甲基苯腈蓝，用 10 mL超纯水溶解；称取 50.0 g 蔗糖，用 30 mL 水溶解，混合三种溶液，加超纯水定容至 100 mL， 在 4 ℃下保存。 A.8 0.01 mol/L 磷酸缓冲液 （PBS，pH 7.2 ） A.8.1 A 液 0.2 mol/L 磷酸二氢钠水溶液，称取NaH PO ·H2O 27.6 g，溶于超纯水中，定容至 1 000 mL。 2 4 A.8.2 B 液 0.2 mol/L 磷酸氢二钠水溶液，称取Na HPO ·7HO 53.6 g，（或Na HPO ·12HO 71.6 g 或 2 4 2 2 4 2 Na HPO ·2HO 35.6 g）加超纯水溶解，定容至 1 000 mL。 2 4 2 A.8.3 0.01 mol/L、pH7.