酵母双杂交系统.pdfVIP

解螺旋 陪伴医生科研成长 酵母双杂交系统 1.实验原理 酵母的转录激活因子GAL4 由两个可以分开的、功能上相互独立的结构域DNA 结合域(DNA binding domain ,BD)和的转录激活域(transcription activation domain,AD)。BD 可以和 上游激活序列(upstream activatingsequence，UAS)结合，而AD 则能激活 UAS 下游的基因 进行转录。但是，单独的 BD 或 AD 不能激活基因转录，它们之间只有通过某种方式结合在一 起才具有完整的转录激活因子的功能。酵母双杂交系统主要利用酵母的 GAL4 的这个特性通 过两个杂交蛋白在酵母细胞中的相互结合及对报告基因的转录激活来研究活细胞内蛋白质 的相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能够通过报告基因敏感地检测到。 2.实验目的 1) 发现新的蛋白质和蛋白质相互作用； 2) 在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用； 3) 筛选药物作用位点及药物对蛋白相互作用影响； 4) 建立基因组蛋白连锁图。解螺旋 / 3.实验材料 3.1．主要试剂 TE/LiAc 溶液、PEG/LiAc 溶液、TE 溶液、Z buffer/X-Gal 溶液等。 3.2．主要仪器 滤纸、接种环、平板等。 4.实验步骤 4.1．酵母菌株的保存与表达型验证 1)用接种环将冻存在-70 C°的酵母Y190 贮备备液划于 YPD 琼脂培养平板上，在 30 C° 1 解螺旋 陪伴医生科研成长 培养，直到菌落直径达到 2mm，约需3-5 天，密封平板，4°C 保存。 2)正常的 Y190 菌落由于 ade2-101 突变而呈粉红色，并且直径2 mm。挑取3-4 个菌 落置于不同培养平板上(SD/-Trp，SD/-Leu,，SD/-His，SD/-Ura，YPD)，培养 4-6 天。核 对其不同的生长情况。由于 Y190 可以有轻微的 His3 泄漏表达，所以需要在 SD/-His 的培养 基中加入的竞争性拮抗剂 3-AT(3-ammino-l,2,4-triazole，25mmol/L)，以抑制背景生长。 4.2．制备酵母感受态细胞 挑取数个直径 2-3 mm 的酵母单菌落放入 1 ml YPD 液体培养基中，剧烈振荡使菌落分散， 然后转入 50ml YPDA 液体培养基中。以 250 rpm、30°C 的条件培养 16-18h 达到稳定期。将 过夜培养物转入 YPDA 液体培养基中，继续培养 4 h，使OD600 值达到 0.4-0.6。室温下4,000 rpm 离心 5 min 收集菌体，用无菌 IxTE 洗菌体后，用新鲜配制的 1 xTE/LiAc 溶液重悬。 4.3.酵母感受态细胞的转化 1. 制备 PEG/LiAc 溶液。 2. 将各组分在反应管中混勾(BD载体构建产物 0.1 μg + AD 载体构建产物 0.1 μg +鲑精 DNA 0.1 mg)。解螺旋 / 3. 在反应管中加入酵母感受态细胞 100 μl，混匀； 4. 加入 PEG/LiAc 溶液 0.6 ml，混匀； 5. 30 C°培养 30min； 6. 加入 DMSO 70 μl以达到 10%的终浓度，轻轻颠倒混匀； 7. 42°C 水浴中热休克 15 min； 8. 冰浴 10 min； 9. 14,000 rpm 离心 5 s 沉淀细胞； 10. 用 IxTE 重悬细胞。 4.4.共转化产物的培养和处理 共转化的酵母细胞铺于 SD/-Trp/-Leu/-His+3-AT(25mM)培养平板上。30°C 倒置培养 7-10 天 ，直至菌落出现。选择直径2 mm 的淡粉色菌落,用牙签重新点种在新鲜的 SD/-Trp/-Leu/-His+3-AT(25mM)培养平板上，继续培养 2-4 天，此时可进行半乳糖苷酶活性 检测。