DNA 片段原位标记（TUNEL法）.pdfVIP

解螺旋 陪伴医生科研成长 细胞凋亡检测（TUNEL 法） 1. 实验原理 细胞在发生凋亡时，会激活一些DNA 内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。 细胞凋亡时抽提DNA 进行电泳检测，可以发现180-200bp 的DNA ladder。基因组DNA 断裂 时，会暴露出 3-OH 基团。利用末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase,TdT)催化，将可观测的标记物，如荧光素等标记到暴露的3-OH 上，再通过荧 光检测装置获得具体的数值，便可获得细胞凋亡情况的数据，这就是 TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)法检测细胞凋亡的原理。由于正常的或者处于增殖的细胞几乎没 有DNA 断裂，坏死的细胞也很少DNA 断裂，没有3-OH 形成，很少能够被染色，因此，TUNEL 法能够特异性检测凋亡细胞。TUNEL 法灵敏度高，特异性好，可用于石蜡包埋组织切片、冰 冻组织切片、培养的细胞，在细胞凋亡的研究中已被广泛采用。 目前TUNEL 一般使用过氧化物酶标记法：利用TdT 的催化给DNA3-OH 基团加上标记物 （如地高辛、生物素等）标记的 dUTP，随后和辣根过氧化物酶(HRP)标记的 Streptavidin (Streptavidin-HRP)结合，然后在HRP 的催化下通过DAB 显色来显示凋亡细胞。 2. 实验目的 检测组织或细胞中，细胞凋亡情况. 解螺旋/ 3. 实验材料 3.1. 主要试剂 市面上有很多TUNEL 试剂盒，可直接购买使用，不需要自行配置试剂 3.2. 主要仪器 荧光显微镜 1 解螺旋 陪伴医生科研成长 4. 实验步骤 （来源于碧云天TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒说明书，若采购其他品 牌试剂盒，按说明书操作即可） 4.1 样品预处理 1. 对于贴壁细胞或细胞涂片： a. 用PBS 缓冲液洗涤1 次。 b. 如果细胞贴得不牢，可以干燥样品使细胞贴得更牢。 c. 用4%多聚甲醛或碧云天生产的免疫染色固定液(P0098)固定细胞30 分钟。 d. 用PBS 或HBSS 洗涤1 次。 e. 加入碧云天生产的免疫染色强力通透液(P0097)或含0.3% Triton X-100 的PBS，室 温孵育5 分钟。 f. 用PBS 或HBSS 洗涤1 次。 g. 在碧云天生产的内源性过氧化物酶封闭液(P0099)或PBS 配制的0.3%过氧化氢溶液 (0.3% H2O2 in PBS)中室温孵育20 分钟，以灭活切片内源的过氧化物酶。随后用PBS 或HBSS 洗涤3 次。 h. 转步骤5。 2. 对于悬浮细胞或细胞悬液： a. 收集细胞(不超过200 万细胞)，用PBS 或HBSS 洗涤1 次。 b. 涂片，使细胞粘附在载玻片上。可以干燥样品使细胞贴得更牢，或使用适当的粘附 试剂。解螺旋/ c. 用碧云天生产的免疫染色固定液(P0098)或4%多聚甲醛固定细胞30 分钟。 d. 用PBS 或HBSS 洗涤1 次。 e. 用加入碧云天生产的免疫染色强力通透液(P0097)或含0.3% Triton X-100 的PBS， 室温孵育5 分钟。 f. 用PBS 或HBSS 洗涤1 次。 g. 在碧云天生产的内源性过氧化物酶封闭液(P0099)或PBS 配制的0.3%过氧化氢溶液 (0.3% H2O2 inPBS)中室温孵育20 分钟，以灭活切片内源的过氧化物酶。随后用PBS 或HBSS 洗涤3 次。 h. 转步骤5。 3. 对于石蜡切片： a. 二甲苯中脱蜡5-10 分钟。换用新鲜的二甲苯，再脱蜡5-10 分钟。无水乙醇5 分钟。 90%乙醇2 分钟。70%乙醇2 分钟，蒸馏水2 分钟。 b. 滴加 20 μg/ml 不含 DNase 的