膜蛋白的提取与分离.docx

膜 蛋 白 的 提 取 与 分 离 膜蛋白的分离 一、简介： 1细胞质膜资料 1895 年,Overton 从研究细胞透性得出 细胞膜由连续的脂类物质组成 。 1925 年 GorterGrendel: 用脂单分子膜技术测定细胞膜中脂分子的总 面积，提出： 细胞膜是由双层脂分子组成 。 1935 年 DanielliDavson ：从测定膜的表面张力得出细胞膜的 三明治 结构模型 ，即蛋白质－脂 -蛋白质。 1959 年 Robertson: 用电镜观察生物膜提出 单位膜模型 ，将膜的分子 结构与超微机构统一起来 厚度： 2(暗)+3.5( 亮)+2 （暗） =7.5 细胞质膜的主要功能概括如下： 为细胞的生命活动提供相对稳定的内环境 ; 选择性的物质运输，包括代谢底物的输入与代谢产物的排除，其中伴随着能量的传递； 提供细胞识别位点，并完成细胞内外信息跨膜传递； 为多种酶提供结合位点，使酶促反应高效而有序地进行； 介导细胞与细胞、细胞与基质之间的连接 ; 质膜参与形成具有不同功能的细胞表面特化结构。 2膜蛋白 虽动物细胞主要有 9种膜脂，而膜蛋白的种类繁多， 多数膜蛋白分子数 目较少，但却赋予细胞膜非常重要的生物学功能。 根据膜蛋白分离的难易及其与脂分子的结合方式，膜蛋白可分为两大 类型：外在膜蛋白、内在膜蛋白。 外在膜蛋白为水溶性蛋白， 靠离子键或其它较弱的键与膜表面的蛋白质分子或脂分子结合，因此只要改变溶液的离子强度甚至提高温度就可以从膜上分离下来，膜结构并不被破坏。 内在膜蛋白与膜结合非常紧密，一般讲只有用去垢剂(detergent) 使膜解后才可分离出来。 获得大量有生物学活性的质膜蛋白对我们显得非常的重要。 附注：使用分级抽提方法获得的 “膜蛋白 ”中只有很少一部分是具备多跨膜区的整和膜蛋白，膜蛋白，到目前为止，仍然是蛋白组学的一个 瓶颈，不管采用２－Ｄ技术也好，ＩＣＡＴ乃至 proein microarray 都还不能有效解决这一问题。 二、蛋白抽提 三、 及蛋白分离，我 想到：超速离心， 析法、超 法、凝胶 法、等 点沉淀法、离子交 析、 和 析、吸附 析、逆流分 溶、 解法 ⋯⋯ 有 些方法常常 合到一起 特定的物 行分离 化。由于蛋白 种 繁多，不同的蛋白 由于 构和 成的差异， 其溶解度也各不相同 .根据蛋白 的溶解特性， 同 可 不同的溶 提取，分 水溶液提取和有机溶 提取 . 四、但是 膜蛋白的提取与 胞 蛋白，核蛋白提取不同之 在于它是嵌在膜中的，水溶性不好，基本方法就是用不同的离心速度去掉胞 蛋白等，最后用去 把蛋白从膜中 放出来。膜蛋白分离 化的重要步 是 适当的增溶用表面活性 ，一般常用的有胆酸 ，CHAPS(一种离子去 ），Emulgen 和 Lubrol 等表面活性 。 五、 1、分离膜蛋白的方法（原 性） ： 六、 1）先分离膜，然后提取；如 用冷 交替法、反复 融法、超声 破碎法、玻璃匀 法、自溶法和 理法使得 胞破碎，然后通 剃 度离心得到含有膜蛋白的粗 分。 （例如： michael11 液氮研磨 ， 加入匀 冲液及蛋白 抑制 。差速离心。蔗糖密度梯度离心。收 集37% 与41% 的成分，即 膜部分。裂解即可收集膜蛋白） 七、 2）用特殊的去 性的分离。从膜上提取蛋白有 多困 . 在多数情况下，都是采用去垢 将疏水蛋白从其膜 构中溶解下来， 然后将蛋白 定 .去垢 的 通常是依据他 所需要蛋白 的提 取效率来确定，但在某些情况下， 要考 到以后的 化步 . 然 多膜蛋白必须在去垢剂存在的情况下进行纯化，但最终仍可能需要除去去垢剂 .这常常会引起蛋白质失活，但如果蛋白质是用于测序的，他将不是一个问题 .如果不是用于测序的， 可考虑使用能够黏附去垢剂的疏水珠 .许多文献和生化试剂供应商的产品目录中， 都介绍有许多种不同的可用来溶解膜蛋白的去垢剂 .然而，他们并不是普遍适用的 .在设计膜蛋白溶解方案时，必须考虑某一去垢剂的特殊性质 .如 triton X-100 在280nm 处有吸收，如果某蛋白质的测试与 280nm 处的吸收有关， 就应避免使用这类去垢剂 . 八、将膜制剂与胞质蛋白及细胞核分离后，再进一步从细胞膜制剂中 将所需的膜蛋白增溶下来 . 这种做法的好处是可以用强烈的去垢剂提 取细胞骨架的相关蛋白，而无需考虑胞质蛋白、细胞核成分或染色质 成分的混入 .使用这种方法所获得的膜蛋白，无论在种类上还是数量 上，都比酸溶解法所得到的蛋白（ 5000Da ）要多.一般提取的膜蛋白 量往往只占膜蛋白总量的不足 0.1% ，所以充分的膜蛋白的提取， 无疑 对于研究膜蛋白的结构和功能都是非常重要的 .第二种方法简单，可靠，