微生物染色_精选.docxVIP

实验 3 微生物的染色 实验目的 了解微生物的染色原理。 学习微生物涂片染色操作技术。 掌握微生物单染色及革兰氏染色方法。 染色原理 一般微生物，特别是细菌无色透明，在光学显微镜下，菌体与背景的反差很小，难以分辨其形态与结构，染色后可增加其反差，以利于观察。 单染(普通染色 ) 单染是只用一种染料使菌体着色，便于观察菌体的形态。 菌体内含有大量的蛋白质，使微生物细胞具有两性电解质性质，在某一 pH 值时，菌体所带的正负电荷相等，该 pH 值即为细胞的等电点 (pI) 。通常细菌的等电点约为 2～5。 当环境的 pH 值比菌体的等电点低时，菌体带正电荷，易与带负电荷的酸性染料结合。在细菌所要求的 pH 值(中性或略大于中性 )条件下，细菌带有负电荷，故多以碱性染料染色。常用的碱性染料有结晶紫、龙胆紫、美蓝、碱性品红、 孔雀绿、番红花红及中性红等。 革兰氏染色 (复染色法或鉴别染色法 ) 革兰氏染色法是细菌学中重要的鉴定方法。该方法是 l884 年由丹麦学者 Christain Gram 创立的，此后人们在实践中又作了一些改进。通过这种方法可将细菌分为革兰氏染色阳性细菌 (G+)和革兰氏染色阴性细菌 (G-) 两大类。其基本原理如下。 革兰氏染色结果是由细菌的细胞壁决定的。革兰氏阳性细菌的细胞壁肽聚糖含量高且呈网状结构，细胞壁较厚，类脂质含量低；革兰氏阴性细菌的细胞壁肽聚糖含量低，细胞壁薄，类脂质含量高。前者用酒精脱色时，细胞壁因脱水肽 聚糖层网孔变小， 其通透性降低， 使结晶紫 -碘的复合物不易被抽取而继续留在细胞内， 经脱色和复染后仍保留着初染剂结晶紫的颜色 (紫色)；后者用酒精脱色时， 类脂质被酒精溶解， 细胞壁通透性增大， 使结晶紫 -碘的复合物易被抽取出来， 紫色褪去，用复染剂复染后，细胞的颜色即呈复染剂的颜色 (红色)。革兰氏染色最关键的步骤是酒精脱色。事实上，用 结晶紫进行初染时所有的细菌都被染成紫色。 碘是一种媒染剂， 能与结晶紫结合成结晶紫 -碘的复合物， 以增强染料与细菌的结合力。只有经过酒精处理，再经复染，不同的细菌才会显现出不同的染色结果。 实验仪器、材料 显微镜、载玻片、接种环、酒精灯、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸等。(2)美蓝染液、结晶紫染液、碘液、 95% 乙醇、番红花红染液。 (3)大肠杆菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌、活性污泥等。 操作步骤 单染 ①涂片 (图 12) 在干净的载玻片中央滴一滴无菌蒸馏水，将接种环在火焰上烧灼，冷却后，以无菌操作 (图 12)挑取少量菌种于载玻片水滴中，或用吸管直接滴一滴活性污泥悬液于载玻片上，混匀并涂成薄膜，注意涂布面积不要太大。 ②干燥 自然干燥。 ③固定 将已干燥的涂片正面朝上，于火焰顶上迅速通过 2～3 次，使其蛋白质凝固，以固定细菌外形，并使其不易脱落。但切忌直接在火上烧玻片，以防菌体变形。 ④染色 在涂片薄膜上滴加染液 (美蓝或结晶紫 )1～2min 。 ⑤水洗 倾斜载玻片，打开水龙头，用细水流冲洗 (最好沿载玻片对角线冲洗 )，直至冲洗水无色为止。 图 12 无菌操作和涂片方法 烧接种环灭菌； (b) 拔下棉塞； (c)轻烧试管口； (d) 接种环伸进试管挑菌； (e)取出接种环，再烧一烧试管口； (f) 塞好棉塞， (g)涂片； (h) 烧灼接种环；⑥镜检 用吸水纸轻轻地将涂片边缘的水珠吸掉，晾干后于显微镜下观察，并绘图。 革兰氏染色 (图 13) ①涂片 同单染。 图 13 革兰氏染色过程 (a)加结晶紫染 lmin；(b) 水洗； (c)加碘液媒染 lmin ；(d)水洗； (e) 酒精脱色； (f)水洗； (g)番红花红复染 2min ；(h) 水洗； (i)用吸水纸吸干 ②干燥 同单染。 ③固定 同单染。 ④初染 结晶紫染色 lmin ，水洗。 ⑤媒染 用碘液媒染 lmin ，水洗。 ⑥酒精脱色 倾斜载玻片，滴加乙醇至流下的乙醇不显紫色 (或 20～30s) ，立即水洗。这是革兰氏染色最关键的一步，脱色过度，本来的阳性菌会被误认为是阴性菌；脱色欠度，阴性菌会被误认为是阳性菌，均造成错误结果。 ⑦复染 番红花红复染 2min ，水洗。 ⑧镜检 用吸水纸吸走水滴，晾干后，用显微镜观察。 实验报告 绘出菌体形态，并给出革兰氏染色结果。思考题 简述微生物染色原理。 革兰氏染色中若不用番红花红复染，能否区分 G+ 菌和 G-菌? 请解释。