荧光蛋白基因在大肠杆菌中的表达与检测.pdfVIP

绿色荧光蛋白基因在大肠杆菌中的表达与检测 一、 背景介绍 1．绿色荧光蛋白 1955 年，Davenport 和 Nicol 在太平洋海里的一种发光生物—维多利亚水母 (Aequorea victoria) 中发现并发表了荧光蛋白的生物发光现象， 但是对生物发光现象的机理并不了解。 1962 年，日本科学家下村修在水母中纯化鉴定出了一种能催化化学发光的蛋白质分子并将 其命名为 aequorin ，aequorin 能将化学能转化为光能，从而产生出波长为 470nm 的蓝色光 (lmax=470nm) ，但是水母发出的光是独有的绿色，因此水母发光的蛋白质并非 aequorin 。 与此同时，发现和分离了一个受紫外线激发能发出绿色荧光的蛋白质—绿色荧光蛋白 (GFP) 。 1971 年， Morin 和 Hastings 提出了 GFP这个名称。 1985 到 1992 年间，科学家 Douglas Prasher 测定完成了 aequorin 和 GFP的基因和蛋白质序列， 并通过蛋白质序列分析和核磁 共振分光术 (NMR spectroscopy) 确定了 GFP发光位点。 1994 年，美国科学家钱永健开始改 造 GFP，目前所用的大多数是钱永健实验室改造后的变种，有的荧光更强，有的可激活、变 色。1996 年，解析得到了 GFP的晶体结构， 它的发光过程是也在日后的应用中得到了解答。 纵观整个过程，从 1961 年到 1974 年，下村修的研究遥遥领先，却很少有人注意。在 1974 年以后，特别是八十年代后，绿色荧光蛋白的研究得到了广泛的重视和发展。 绿色荧光蛋白，分子质量约为 28kDa，由 238 个氨基酸构成，第 65 ～67 位氨基酸 (Ser-Tyr-Gly) 形成发光团，经共价键连接而成对羟苯甲基咪唑烷酮，它可以被光激发产生 荧光， 是主要发光的位置。绿色荧光蛋白分子的形状呈圆柱形，就像一个桶，发光的基团位 于桶中央，因此，它可形象地比喻成一个装有色素的“油漆桶” 。其发光团的形成不具有物 种专一性，发出的荧光稳定，且不需要依赖其他基质而发光。 GFP的优点很多： 首先，它本身稳定， 不需要任何反应底物和辅助因子， 且无种属限制， 可在多种生物细胞中表达发出稳定荧光， 在 450～490nm 蓝光激发下 , 发光能保持 10min 以 上。其次， 其分子量小，对目的基因的功能无任何影响，融合蛋白具有与 GFP一样的荧光性 质，对细胞没有毒性。最后， GFP观察方便，利用激光扫描共聚焦显微镜，甚至普通显微镜 都可以观察到活细胞内蛋白的变化、活动，用肉眼就可对辨别细胞是否表达及其表达水平。 作为一种新型的报告基因， 绿色荧光蛋白在生命科学的各个领域得到广泛的应用：利 用绿色荧光蛋白的特有发光机制，可将 GFP作为蛋白标签。就是利用 DNA 重组技术，将目 的基因与 GFP基因构成融合基因， 转染或转化至合适的细胞进行表达， 而后借助荧光显微镜 观察细胞内活体中标记的蛋白质。 绿色荧光蛋白也可用于大规模药物筛选。 另外， 由于绿色 1 荧光蛋白独特的光信号传导机制及其在表达后易被周围化学环境和蛋白之间的相互作用影 响的特性， 极适用于成为活细胞体内的光学感受器。 近年来， 由于融合抗体具有发射荧光和 与抗原结合两种特性， 所以将其用做免疫染色的检测试剂， 直接用于流式细胞仪、 免疫荧光 的标记、肿瘤的