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实验六、抗菌药物的体外药效试验 （药敏试验） 各种病原菌对抗菌药物的敏感性不同，同种细菌的不同菌株对同一药物的敏 感性有差异，检测细菌对抗菌药物的敏感性，可筛选最有疗效的药物，用于临床 对控制细菌性传染病的流行至关重要。此外，通过药物敏感试验可为新抗菌药物 的筛选提供依据。药敏试验的方法很多，普遍使用的有滤纸片扩散试验 （Kirby-Baueer Dice Diffusion）；最低抑菌浓度试验（Minimum Inhibitory Concentration, MIC） 和 最 低 杀 菌 浓 度 试 验 （ Minimum Bactericidal Concentration, MBC）。 ［目的要求］ 1、熟悉体外抗菌试验操作技术。 2 、掌握药物抗菌能力体外测定的常用方法及其用途。 ［实验原理］ 常用的体外测定药物抑菌能力的方法有两大类：琼脂渗透法与浓度系列稀释 法。琼脂渗透法时利用药物能够渗透至琼脂培养基的性能，将实验菌混入琼脂培 养基后倾注成平板；或将试验菌均匀涂于琼脂平板的表面，然后用不同的方法将 药物置于已含试验菌的琼脂平板上。根据加药的操作方法不同而有滤纸片法、打 洞法、管碟法及挖沟法等。经适宜温度培养后观察药物的抑菌能力。浓度系列稀 释法时把药物稀释成不同的系列浓度，混入培养基内，加入一定量的试验菌，经 适宜温度培养后观察结果，求得药物的最低抑菌浓度（MIC ）。 1、细菌：所用细菌应包括主要致病菌。革兰氏阳性球菌包括金黄色葡萄球 菌(产酶与不产酶菌株) 、表皮葡萄球菌，链球菌、肠球菌等。革兰氏阴性球菌如 淋球菌等。革兰氏阴性杆菌包括流感杆菌、肠杆菌科细菌 8～10 种，绿脓杆菌与 其它假单孢菌属及不动杆菌属等，厌氧菌包括脆弱类杆菌、消化球菌和消化链球 菌等。对临床应用有代表性的菌株数量，创新药应不小于 1000 株。其它类新药 根据新药抗菌谱宽窄可作 200-500 株。试验时应包括有国际公认质控菌株(如金 葡菌 ATCC25925 ，大肠杆菌ATCC25922 和绿脓杆菌 ATCC27853 等) 。 2 、培养基：选 MH(Muelkr-Hintop)培养基。链球菌、流感杆菌需接种到巧克 力琼脂平板或加 5 ％羊血。淋球菌接种到哥伦比亚培养基上。 3 、药物配制：试验样品与阳性对照药品均应用称重法求出效价并按盐基比 例折算出实际效价。所试药物用磷酸缓冲液或灭菌注射用水溶解，配制成溶液。 少数难溶药物可加少许相应助溶剂，再用缓冲液或灭菌注射用水稀释至所需浓度。 4、试验方法： ① 最小抑菌浓度(MIC)测定法，采用平皿或试管二倍稀释法测无细菌生长 平皿或试管中所含药物的最小浓度即为最小抑菌浓度。 ② 最小杀菌浓度（MBC ）测定法，先测出MIC ，再依次存未见细苗生长 各管培养物分别吸取 0.1ml ，倾倒于平皿上，37 再培养 18 小时，平皿 上菌落数小于 5 个的最小稀释度的药物浓度即为最低杀菌浓度。 5 ③ 杀菌曲线（KCs ）实验 ，将所试菌液约 10 菌落计数单位(CFU ／ml)与 抗菌药物混合，定量取样于平皿培养基，孵育后计算其活菌数，并绘 制出时间杀菌曲线。实验应设空白对照管与已知药物对照试验。 5、培养条件对 MIC 的影响： ① pH 值的影响，将培养基的 pH 调整，测定药物对所试细菌(临床常见致病 菌)1～2 株 MIC 的影响。 ② 细菌接种量的影响, 在其它条件不变时改变细菌接种量，比较不同菌量 对 MIC 的影响。 ③ 血清蛋白结合的影响：如采用 25 ％、50 ％、75 ％等不同的血清浓度与不 含血清的培养基观察血清含量对 MIC 的影响。 ［试验内容］ （一） 滤纸片法（圆纸片扩散试验） ［材料］无菌平皿 1 只, 无菌 1ml 吸管 1 支,无菌小滤纸片, 待检药（1 个平 板可做 1 种或多种药物实验）, 琼脂培养基（瓶装或定量分装 15～20ml 于大试 管，灭菌，备用）, 实验菌肉