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脂质体转染实验步骤 脂质体（ LR）试剂是阳离子脂质体 DOTMA和 DOPE的混合物（ 1：1）。它适用于把 DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中，是目前条件下最方面的转染方法之一。 转染率高，优于磷酸钙法，比它高 5-100 倍，能把 DNA和 RNA转染到各种细胞。 用 LR进行转染时，首先需要优化转染条件，应找出该批 LR 对转染某一特定细胞适合的用量、作用时间等，对每批 LR 都要做。先要固定一个 DNA的量和 DNA/LR混合物与细胞相互作用的时间， DNA可从 1-5ug 和孵育时间 6h，开始，按这两个参数绘出相应 LR需用量的曲线， 再选用 LR和 DNA两者最佳的剂量， 确定出转染时间。因 LR 对细胞有一定的毒性，转染时间以不超过 24h 为宜。 细胞种类： COS-7、BHK、NIH-3T3、Hela 和 Jurkat 等任何一种细胞均可作为受体细胞。 1、操作步骤（方法一）： （1）细胞培养 ：取 6 孔培养板，向每孔中加入 2ml 含（ 1-2 ） x 10^5 个细胞 的培养基， 37℃、 18% CO2培养基 40%-60%汇合时。 （2）转染液制备：在聚苯乙烯管中制备以下两液（为转染 1 个空细胞所用的 量）。 A 液：用不含血清培养基稀释 DNA使浓度为 1-10ug ，终量 100ul 。 B 液：用不含血清培养基稀释 LR，使终浓度为 2-50ug ，终量 100ul 。 轻轻混合 A 液、 B 液，室温中置 10-15min ，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染。 （3）转染准备：用 2ml 不含血清培养基漂洗 2 次，再加入 1ml 不含血清培养 基。 （4）转染：把 A/B 复合物缓缓加入培养基中，摇匀，置 37℃温箱中 6-24h ， 吸除无血清转染液，换入正常培养基继续培养。 （5）其余处理：如观察、筛选、检测等与其他转染法相同。 （6）注意：转染时切勿加血清，血清对转染效率有很大影响。 2、快速脂质体转染法操作步骤（方法二）： 将细胞以 5 x 10^5 个/ 孔接种于 6 孔板中培养 24h，使其达到 50%-60% 板底面积。 在试管中配制 DNA脂-质体复合物。 a、在 1ml 无血清 DMEM中稀释 PSV1-neo质粒 DNA或供体 DNA。 b、旋转 1s，再加入脂质体悬液，旋转。 c、室温下放置 5-10min ，使 DNA结合在脂质体上。 弃去细胞中的旧液，用 1ml 无血清 DMEM洗细胞 1 次后弃去，向每孔中直接加入 1mlDNA脂-质体复合物， 37℃培养 3-5 天。 再于每孔中加入含 20%胎牛血清的 DMEM，继续培养 14-24h 。 吸出 DMEM-DNA脂-质体混合物加入新鲜含 10%胎牛血清的 DMEM，2ml/孔，再培养 24-48h 。 用细胞刮或消化法收集细胞，以备分析鉴定。 3、稳定的脂质体转染法： 接种细胞同前述，细胞长至 50%板底面积可用于转染。 DNA脂-质体复合物制备转染细胞同前。 在每孔中加入 1ml 含 20%胎牛血清的 DMEM，37℃培养 48h。 吸出 DMEM，用 G418选择性培养基稀释细胞，使细胞生长一定时间， 筛选转染克隆，方法参照细胞克隆筛选法进行。 细胞转染技术总述 一、细胞转染途径 转染大致可分为物理介导、 化学介导和生物介导三类途径。 电穿孔法、显微注射和基因枪属于物理介导技术； 化学介导方法很多，如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体 转染方法、和多种阳离子物质介导的技术； 生物介导方法， 有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。 1、 物理介导 （ 1） 电穿孔法：靠脉冲电流在细胞膜上打孔而将核酸导入细胞。 优点：转染效率较高 缺点：需要昂贵的仪器（电穿孔仪）；对细胞的损伤较大，每次转染需要更多的细胞和 DNA；每种细胞电转的条件都需要进行多次优化。 2）显微注射：借助显微注射器直接把 DNA注入核内，使之整合入受体细胞基因组中。 优点：转染效率高，可用于瞬时转染和稳定转染 缺点：导入 DNA时需要一个细胞一个细胞注射，不适合大量转染 （ 3）基因枪：依赖携带了核酸的高速粒子将核酸导入细胞内。 2、 化学介导 （ 1）磷酸钙共沉淀法： 磷酸钙有利于促进外源 DNA与靶细胞表面结合，氯化钙 +DNA+磷酸缓冲液按一定的比例混和，形成极小的磷酸钙 -DNA复合物沉淀黏附在细胞膜表面，借助内吞作用进入细胞质。沉淀颗粒的大小和质量对于转染的成功至关重要。 优点：能用于任何 DNA导入哺乳类动物，瞬时转染和稳定转染。 缺点：转染效率低： 进入细胞的 DNA只有１％－５％可以进入细胞核， 其中 只有不到１％的 DNA可以与细胞 DNA整合，在细胞中进行稳定表达。 重复性不佳