HIS镍柱纯化方法.pptxVIP

纯化前准备 推荐在中性至弱碱性条件下（pH 7-8）结合重组蛋白。磷酸盐buffer是常用的缓冲液，Tric-Cl在 一般情况下可用，但要注意它会降低结合强度。 避免在buffer中包含EDTA或柠檬酸盐等螯合剂。 若重组蛋白以包涵体形式表达，在所有的buffer中添加6 M盐酸胍或8 M尿素 避免缓冲液中有高浓度的电子供体基团，比如：NH4，甘氨酸，精氨酸，Tris，等等 各种缓冲液里不能有高浓度的强还原剂，，比如DTT，防止二价Ni被还原； 不能含离子型的去垢剂，比如SDS，防止Ni流失； 缓冲液里可以加入甘油，防止蛋白之间由于疏水相互作用而发生聚集沉淀，甘油浓度最高可达 50%（v/v） 缓冲液里NaCl的浓度应在300mM到2M之间； 可加入非离子型去垢剂，如Triton，Tween，NP40等，最高2%，可以减少背景蛋白污染和去除 核酸污染 注： 包含尿素的样品可直接进行SDS分析，若样品中包含盐酸胍，在SDS前则需先用含 有尿素的buffer进行透析 除利用咪唑洗脱蛋白，其它方法，如低pH值法等可被应用，详见说明书 Binding buffer 中咪唑的浓度 在洗涤时所用的Binding buffer 中咪唑浓度越大，重组蛋白纯度越高。但过高的咪唑浓度将导 致蛋白的洗脱。合适的咪唑浓度需要优化。 Buffer 的准备 所用的水及化学物质须是高纯度的。Buffer 在使用前需经0.45μm滤膜过滤。所用高纯度的咪 唑需在280nm 处无吸光度或吸光度极低。;温和地颠倒瓶中的Ni-NTA Agarose 数次。 吸取2ml的树脂加入15ml离心管中，使树脂在重力(5–10 minutes)或低速离心(5 minute at 500 × g)，轻柔的吸出上清。 加入5ml的无菌蒸馏水，温和的颠倒柱子3min，离心 5 minute at 500 × g，轻柔的吸出上清。 用bingding buffer 重复第3步。 在Ni 柱中加入等体积的bingding buffer，制成50%的slurry Ni 柱子的 beads 浸泡在 20% ethanol 中，倾除 20% ethanol 溶液，用蒸馏水将 beats 调成 75% （v/v）的浓浆状的凝胶。.沿玻璃棒一次倒入柱子中，静置。 样品与Ni 柱结合 每1ml 50%的slurry中加入4ml 的样品。1ml 50%的slurry 可结合20mg His-蛋白 将混合物室温，低速振荡孵育1h Buffer 洗涤及洗脱 离心 5 minute at 500 × g，轻柔的吸出上清。上清保存放在4℃ for SDSanalysis。 用1 ml Binding Buffer洗涤柱子，在摇床上温和的振荡2min，然后低速离心 5 minute at 500 × g ，小心吸出上清，重复该步一次。上清保存放在4°C for SDS analysis。 用0.5 ml Elution buffer洗脱柱子，方法同4。重复该步三次。分管收集4次洗脱液，存放在4°C for SDSanalysis。 纯化柱的再生： 如果纯化同一种蛋白，Ni-NTA resin不需要再生，可以重复使用5－7次。 用5倍柱体积的含50 mM EDTA，20 mM 磷酸盐，0.5 M NaCl pH 7.4的buffer 洗涤柱子，洗去螯合的镍离子。 用5倍柱体积的binding buffer洗涤柱子 用5倍柱体积的无菌去离子水洗涤柱子 用0.5倍柱体积的含0.1 M 的NiSO4的无菌水溶液装填 用5倍柱体积的无菌去离子水洗涤柱子 用5倍柱体积的bingding buffer洗涤柱子 加入20％的乙醇4-30℃长期保存。 lysis buffer 中加咪唑的目的是与杂蛋白竞争，使那些与填料亲和力弱的杂蛋白不能挂柱； wash buffer 中加咪唑是为了洗去大部分已挂柱的杂蛋白（也会洗去少量目的蛋白）； elution buffer 中加梯度咪唑，而且咪唑浓度渐高，是咪唑和目的蛋白竞争性结合填料，从而把目的 蛋白从柱上洗脱。;③ 10 倍柱床体积的ddH2O 洗柱，1ml/min 除去柱上残余蛋白 ① 1M NaOH 充满柱并保持 2h ② 10 倍柱床体积的binding buffer 洗柱，1ml/min (可省) ③ 10 倍柱床体积的ddH2O 洗柱，1ml/min 挂镍