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无菌检验过程 目的：本实验系将医疗器械或其浸提液接种于培养基内，  以检验供试品是否有细 菌和真菌污染。 一、进入无菌室前准备 工作人员进入无菌室前， 必须用消毒液或肥皂洗手消毒， 然后在缓冲间更换专用 工作服、鞋或鞋套、帽子、口罩和手套，双手再用 75%的酒精消毒，方可进入操 作间操作。 二、进入无菌室 1、无菌室灭菌：无菌室应在每周和每次操作前用  75%酒精或 0.1%新洁尔灭擦拭 工作台面及可能污染的死角，开启无菌空气过滤器及紫外灯 1h。在每次操作完 毕，同样使用上述消毒溶液擦拭工作台面， 除去室内湿气， 用紫外灯杀菌不少于 半小时。 2、工作台面沉降菌检测： 取直径为 90mm的培养皿，注入融化的营养琼脂培养基20ml，30-50 ℃培养 48h 证明无菌后，取 3 只培养皿在无菌操作台或超净工作台 平均位置打开上盖，暴露 30min 后盖好置 30-35 ℃培养 48h 后取出检查。 3 只培 养皿上生长的菌落数应不超过 1 个（百级清洁度要求）。 实验所用仪器：超净工作台、光学显微镜、恒温培养箱、压力蒸汽灭菌器、 集菌仪、恒温水浴锅、电热干燥箱等。 实验用具： 试管、注射器、 量筒、三角瓶、移液管、刻度吸管、 精密 pH试纸、 集菌培养器、剪刀、镊子、无菌衣、口罩、灭菌袋或牛皮纸等。 3、与供试液接触的所有器具应采用可靠方法灭菌，置压力蒸汽灭菌器内 121℃ 30min，或支电热干燥箱内 160℃2h。三、无菌检查过程 1、培养基的制备：市售脱水培养基按说明书配制、灭菌。保存在  2-25 ℃、避光 环境。非密闭容器中一般在 3 周内使用，密闭容器中一般在 1 年内使用。 2、培养基的适用性检查 1）无菌性检查：每批培养基随机取不少于  5 支，培养 14 天，应无菌生长。 2）灵敏度检查： a 选取菌种，其传代次数不超过 5 代； b 菌液制备： 接种金葡、 铜绿、枯草的新鲜培养物 （斜面） 至营养肉汤培养基 30-35 ℃培养 18-24h ；生孢的新鲜培养 物至硫乙醇酸盐流体培养基 30-35 ℃培养 18-24h ；白念的 新鲜培养物至改良马丁培养基 23-28 ℃培养 24-48h ；黑曲 的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基 23-28 ℃培养 5-7d 。 c 培养基接种： 金葡 2 支  白念 2 支 硫乙醇酸盐 铜绿 2 支 改良马丁 黑曲 2 支 流体培养基 枯草 2 支 培养基 空白对照 1 支 （ 12ml） 生孢 2 支 （ 9ml） 空白对照 1 支 结果判定：空白对照管应无菌生长， 若加菌的培养基管均生长良好，判定培养基的灵敏度检查符合规定。 2、稀释液、冲洗液 1 稀释液、冲洗液配置后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。 常用有： 0.1%蛋白胨水溶液、 pH7.0 氯化钠 - 蛋白胨缓冲液。（若需要可在灭 菌前加入表面活性剂或中和剂） 3、方法验证试验 当建立产品的无菌检查法时，应进行方法学验证，以证明所采用的的方法适合于该产品的无菌检查。若产品组分或原检查条件发生改变时，检查方法应重新验证。验证时按“ 供试品的无菌检查” 的规定及下列要求进行操作。 1）菌种及菌液的制备，培养基抑菌性检查（删除铜绿增订大肠埃希菌） 2）薄膜过滤法： 规定量的供试品——过滤——冲洗——加入试验菌——过滤 ▲ 每种菌做 1 管不含供试品管作为对照 3）直接接种法 ▲ 硫乙醇酸盐流体培养基： ▲ 改良马丁培养基 金葡菌 2 管 白念 2 管 大肠埃希菌 2 管 黑曲 2 管 枯草 2 管生孢 2 管 （每种实验菌均做一管接入规定量的供试品，另一管作为对照） 试验管：培养基 +供试品 +对应菌 阳性对照管：培养基 +对应菌 阴性对照管：培养基 +稀释液 检测管：培养基 +供试品 （试验管、阳性对照管实验菌应生长良好，检测管阴性对照管应无菌生长） 4）结果判定 与对照管比较， 如含供试品的各管中的实验菌均生长良好， 则说明供试 品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可忽略不计。 4、供试品的无菌检验 1 ）实验前准备：培养基移入前编号，消毒液（酒精、新洁尔灭）擦拭瓶 （管）外壁。 2 ）检验数量：一般情况，若采用薄膜过滤法，应增加 1/2 的最小检验数 量作为阳性对照用；直接接种法，应增加供试品无菌检查时每个培养 基容器接种的样品量作为阳性对照用。 3 ）检验量在：指一次实验所用的供试品总量 （g 或 ml）。不管采用什么方 法，若每支供试品的装量按规定足够接种两份培养基，则应分别接种 硫乙醇酸盐和改良马丁培养基。 4 ）阳性对照：培养基 +对应菌 +供试品 培养 48-72h 应生长良好。 5 ）阴