烟草转化方案.docxVIP

利用农杆菌侵染烟草进行体内瞬时表达的方法 [精华提要 ] 通常，我们可以利用烟草的瞬时表达系统来观察感兴趣蛋白的亚细胞定位（通 过与绿色荧光蛋白构成融合蛋白） 。同时， 还可以检测蛋白的表达量。 这一个过程是通过农 杆菌作为一个工具将目的基因整合到到烟草的细胞内的。 材料与试剂 通常表 4. 乙酰丁香酮 5. 2-（N- 吗啉代 ） 乙磺酸 6. 抗生素 7. 注射器 3. 紫外灯 4. 荧光显微镜 携带表达载体的农杆菌菌株 达载体由 35S 启动子驱动） 2-4 周的烟草植株 3. LB 培养基 工具 1. 50ml 离心管 2. 光谱仪 步骤： 1. 挑取单克隆于5mlLB液体培养中，28- 30 °濃荡培养。通常，LB中加入100ug/ml 庆大霉素（农杆菌株 GV3101 携带抗性）， 50ug/ml 大观霉素（载体携带）。 2. 将 1ml 过夜培养的农杆菌转接到 25mlLB 液体培养基中（加有与 1 相同的抗生素， 另外加入高压灭菌的乙酰丁香酮）。 检测过夜培养的菌液 OD600 的值。 5000g ， 15 分钟集菌，用重悬液重悬菌体，最终 OD600 为 0.4。 室温放置 2-3h 后注射烟草。 将侵染液装入 5ml 注射器内，用拇指按压注射器反板将液体从叶片下表皮注射到烟 草叶片内（勿使用子叶）。注射后，烟草叶片会出现湿润的现象。 注射后 2-5 天，在便携式长波长紫外灯下检测 GFP 荧光信号（只适用于荧光很强的 叶片）。 通过荧光显微镜或者激光共聚交荧光显微镜检测 GFP 信号。同时，可以提取蛋白， 检测蛋白的含量。 配方 加有相应抗生素的 LB 液体培养基（一种抗生素是菌株携带，一种为载体携带）。 乙酰丁香酮（100mM 溶于乙醇，-20 °C!存）。 1M MgCl2 重悬液（10mM MgCl2,10mM 2-（N- 吗啉代）乙磺酸（pH5.6）高温高压灭菌 15分钟, 100uM 乙酰丁香酮，高温高压灭菌 ）。 乙酰丁香酮（来自 Aldrich ）：又名 3 ,5 -二甲基 -4-羟基苯乙酮，或 4-羟基 -3 ,5 -二甲基苯乙酮