二穗短柄草木栓质脂肪醇合成基因BdFAR4的功能研究.pdfVIP

摘 要 摘要 木栓质是由甘油、脂肪族、酚类化合物等组成的植物次生代谢产物，广泛存在于 植物根部，也出现在表皮和周皮等部位，与地上部分存在的角质共同构成了植物为适 应复杂环境变化而形成的疏水性屏障。木栓质与植物的多种抗性相关，对木栓质的研 究有助于阐释植物抗性机理和提升植物抗性，然而目前相关的研究多集中于拟南芥中， 其他物种中的报道较少。前期研究表明：二穗短柄草BdFAR4基因在酵母及番茄中被 证实参与木栓质初级脂肪醇的合成，但该基因详细的功能研究仍有待揭示。二穗短柄 草是麦类作物重要的模式植物，对BdFAR4 的研究可为麦类作物的相关研究提供参考。 本文在前人研究的基础上对 BdFAR4 的功能展开了进一步研究分析。我们利用 CRISPR/Cas9 基因编辑技术和过量表达技术结合二穗短柄草的遗传转化对BdFAR4 进 行了功能验证；对BdFAR4 蛋白进行原核表达；通过亚细胞定位技术在拟南芥原生质 体和烟草表皮细胞中确定了BdFAR4 蛋白的定位信息；对二穗短柄草进行了多种非生 物胁迫处理，探究了BdFAR4 在各胁迫条件下的表达变化。本文的主要结论如下： 1. CRISPR/Cas9 系统成功编辑了二穗短柄草Bd21 植株的BdFAR4 基因序列，产 生了多种突变类型，突变形式包括单碱基的插入、缺失、替换和大片段缺失，造成突 变的位置均涉及靶点序列且集中在PAM 序列上游的3~5 bp 处。 2. 二穗短柄草根部木栓质成分以脂肪酸、初级脂肪醇、ω-羟基酸和α, ω-二羧酸 为主，CRISPR/Cas9 突变系和BdFAR4 基因过量表达系与野生型在各类成分的含量上 并没有显著差异。CRISPR/Cas9 突变系中C20 和C22 初级脂肪醇含量较野生型显著 降低，其中C20 初级脂肪醇含量下降幅度最大，而过量表达系中C20 和C22 初级脂 肪醇的含量较野生型显著升高，表明 BdFAR4 特异地参与二穗短柄草根部木栓质中 C20 和C22 初级脂肪醇的合成。 3. 构建了完整的原核表达BdFAR4 蛋白，表达产物大小约为55 KDa ，经拟南芥 原生质体和烟草表皮细胞的亚细胞定位将BdFAR4 蛋白定位于细胞内质网中。 4. 二穗短柄草BdFAR4 基因表达具有组织特异性，该基因在叶片、节间、小穗、 节、鞘和颖壳组织中表达量低，在根中高表达，其表达量随根部发育先增加后减少。 5. 干旱、PEG 、低温、NaCl 、ABA 和机械损伤处理均能诱导BdFAR4 上调表达。 其中，BdFAR4 受机械损伤诱导上调幅度最大，受低温胁迫诱导上调幅度最小，对干 旱胁迫的响应最快，对机械损伤的响应速度最慢。 关键词：二穗短柄草；木栓质；CRISPR/Cas9；BdFAR4 ；胁迫表达 I 目 录 目 录 摘要I ABSTRACT III 第一章 文献综述 1 1.1 木栓质概述 1 1.1.1 木栓质的分布 1 1.1.2 木栓质的成分和结构 2 1.1.3 木栓质单体间的相互连接 2 1.2 木栓质的生物合成 4 1.2.1 参与木栓质合成的酶和基因 5 1.2.2 木栓质的合成调控 8 1.3 木栓质的生物功能 9 1.3.1 木栓质与非生物胁迫 10 1.3.2 木栓质与生物胁迫 12 1.4 选题的背景及目的意义 13 1.5 技术路线 13 第二章 二穗短柄草BdFAR4 基因的功能验证 14 2.1 材料和方法 14 2.1.1 试验材料 14 2.1.2 试验方法 15