利用ATAC-seq分析拟南芥四种细胞全基因组范围内染色质的开放程度.pdfVIP

摘要 摘要 生殖细胞及其辅助细胞的分离和研究是动植物有性生殖研究的基本内容。开花植 物中的雄性生殖系通过不对称分裂、分化形成单倍体单核小孢子，产生一个包含比较 小生殖细胞的营养细胞；生殖细胞经历第二次有丝分裂，产生两个精子细胞。营养细 胞和精子细胞通过激活不同的遗传和表观遗传机制，分别控制花粉管的生长和生殖细 胞的大小。该过程的全面表征依赖于分离整个雄性配子发育过程中不同类型细胞的有 效分离。目前基于全基因组测序的基因表达数据的不断增长，但对于如何建立、调节 转录程序以及定义细胞身份仍然知之不多。转录因子与基因组中特定DNA 序列基序的 结合是基因调节的重要机制。然而，这些序列受DNA 包装成染色质的阻碍。这些基序 TF TF 与 结合的可及性受到染色质高度调节，进而控制 的结合位置和时间。因此，染 色质结构在基因表达调控中起关键作用，在获取和维持细胞身份中的作用受到越来越 TF 多的关注。由于 与顺式作用元件结合通常与可及的染色质区域相关。鉴定植物全基 TF 因组中这些可及区域的能力将增进对 结合、染色质状态和基因表达调控之间关系的 理解。转座酶可及染色质测序法 （ATAC-seq）用于动物基因组中绘制开放的染色质区 域。在植物中，植物细胞壁、亚细胞器的存在以及稳定的转基因株系的缺乏限制了该 技术的应用。本文描述了一种结合了ATAC-seq 与荧光细胞核分选方法，用以鉴定和 定位拟南芥四种不同类型细胞全基因组的开放染色质区域和潜在的TF 结合位点，并分 析和比较了不同类型细胞的染色质开放程度的差异。主要的研究结果如下： 获得拟南芥叶肉细胞细胞核、花粉精核和营养核、单核期小孢子细胞核、雄性性 母细胞等四种不同细胞。1）通过酶解法和裂解法相结合提取了拟南芥叶肉细胞的细胞 DAPI 90% 核，并去除了线粒体和叶绿体等细胞器的干扰。 染色结果表明： 细胞核处于 2 完整状态，且纯度较好； ）从花絮获得花粉粒的粗提物，用玻璃珠破碎法将花粉粒破 碎释放精核和营养核。利用流式细胞仪分选获得两个明显的细胞群，进一步镜检表明 3 获得高纯度的精核和营养核； ）从拟南芥的花苞中粗提小孢子，用流式细胞仪分选获 得单核时期的小孢子，进一步破碎获得单核期的小孢子细胞核。获得单核小孢子的比 例占97.3%，用玻璃珠破碎法获得单核期小孢子的细胞核，DAPI 染色结果表明细胞核 4 的纯度和完整性较好； ）从处于减数分裂时期的花苞中分离花粉囊，从花粉囊中分离 得到雄性的性母细胞，通过毛细管收集一定量的性母细胞，进一步使用玻璃珠破碎法 得到纯度较高的细胞核。上述高纯度不同类型细胞的分离，为进一步差异染色质的分 析奠定了坚实的基础。 I 西北农林科技大学硕士学位论文 通过ATAC-Seq 法分析了不同细胞类型基因组的染色质开放的情况，以及不同细 胞之间染色质可及性的差异。首先，通过构建PCR 扩增文库，获得大小在200-500bp 之间的片段。经微流控毛细管电泳系统检测表明，构建的ATAC-Seq 文库峰形较宽， 无明显主峰，峰的位置大致在 190-1000bp。ATAC-Seq 结果表明，不同类型细胞的开 transcriptionalstart site TSS 放染色质的区域集中在转录起始位点 （ ， ）附近。进一步推 断染色质的可及区显示，叶肉细胞核中超过90%位于TSS上游3kb 之内，不到10%的 基因位于远端基因间区域。此外，染色质的可及区也高度富集在转录终止位点 （TES）