环状RNA circ0001186在奶牛乳腺上皮细胞中的作用及分子机制.pdfVIP

摘 要 摘要 奶牛乳腺炎是奶牛养殖业中最常见的疾病之一。该疾病是由于乳腺机械损伤、病 原菌入侵和繁殖等原因所引起的，会引起乳液的物理，化学和微生物变化，并且能引起 乳腺组织的病理改变，对奶牛的生殖性能产生影响。环状RNA （circRNA ）是一类具有 调控基因表达功能的分子，包含大量的 miRNA 反应元件 （miRNA response elements ， MRE ），可作为miRNA 的“海绵”，充当竞争性内源RNA （competing endogenous RNAs ， ceRNA ），结合miRNA 并抑制其功能，调控下游基因的表达。基于环状RNA 的相关特 性，本研究室在前期运用金黄色葡萄球菌对奶牛乳腺上皮细胞（Mammary alveolar cells ， MAC-T ）诱导炎性应答后进行的高通量测序研究，发现了一个新型环状RNA (命名为 circ0001186) ，其表达水平显著下调，经生物信息学分析该circRNA 可能与细胞增殖相 关。以MAC-T 为模型，运用RT-qPCR、细胞活力检测法（CCK-8 ）、细胞增殖能力检 测（EDU ）和双荧光素酶报告实验等方法，研究了该环状RNA 对奶牛乳腺上皮细胞生 物学功能的影响以及该环状RNA 作为miRNA 海绵对下游靶基因功能的影响，主要研 究结果如下： （1）通过前期的高通量测序，获得circ-0001186 序列，circ-0001186 全长 874bp， 由其亲本基因ZNF609 的第二个外显子首尾相接环化形成，分别检测了该环状RNA 在 乳腺组织、心、肝、脾、肺、肾、胃、肠中的表达量，结果发现其在乳腺组织中的表达 量较低；以MAC-T 为模型，成功构建了过表达circ-0001186 的MAC-T 细胞系，使用 RNase R 酶消化细胞，验证circ-0001186 的成环特性。运用CCK-8 试验验证circ-0001186 对MAC-T 细胞活力的影响，结果发现，与对照组相比，过表达circ-0001186 组MAC- T 细胞活力明显增强。此外，EDU 细胞增殖染色试验结果也显示，与对照组相比，过 表达circ-0001186 组MAC-T 细胞增殖能力增强。上述结果表明，circ-0001186 可以增 强MAC-T 细胞活力，促进细胞增殖。 （2 ）通过生物信息学分析发现circ-0001186 可与miR-3432a 结合，经序列分析确 定结合位点，分别设计野生型 （WT ）和突变型 （MUT ）引物，扩增序列，将目的片段 连接到psiCHECK2 载体上，与miRNA 模拟物（mimic ）、mimic NC 共转染至293-T 细 胞中，运用双荧光素酶报告实验对预测结果进行验证，结果表明，circ-WT 和miR-3432a mimic 共转染组的相对荧光强度明显低于其他3 组，表明circ-0001186 可与miR-3432a 结合。为了进一步探究miR-3432a 作为circ-0001186 的“海绵”是否可以影响MAC-T 细胞的功能，将miR-3432a mimic 和miR-3432a inhibitor 转染到过表达circ-0001186 的 MAC-T 细胞中，运用CCK-8 试验验证miR-3432a 对过表达circ-0001186 的MAC-T 细 胞活性的影响，结果发现，与miR-3432a inhibitor 组相比，miR-3432a mimic 组过表达 I 西北农林科技大学硕士学位论文 circ-0001186 的 MAC-T 细胞活力减弱，EDU 细胞增殖试验结果也显示，miR-3432a mimic 组的过表达circ-0001186 的MAC-T 细胞增殖能力减弱。通过生物信息学分析发 现miR-3432a 可靶向调控JunD ，经序列分析确定其结合位点，构建包含有WT 和MUT 序列的质粒，与miRNA mimic 、mimic NC 共转染293-T 细胞，运用双荧光素酶报告实 验进行验证，结果表明，JunD-WT 和miR-3432a mimic 共转染组的相对荧光强度明显 低于其他三组，证明miR-3432a 与mRNA JunD 结合。基于以上研究结果，circ-0