细胞培养技术个人总结.docx

总结 ---细胞培养 一． 基本理论概论 原代培养 : 也叫初代培养，指直接从体内取出的细胞、组织和器官进行的第一次的培养。 传代培养：将细胞从一个培养瓶转移到另外一个培养瓶即称为传代或传代培养。 细胞系：原代培养物成功传代后，则称之为细胞系。 （如细胞系的生存期有限，则称之为有 限细胞系；已获无限繁殖能力能持续生存的细胞系，称连续细胞系或无限细胞系。 ） 细胞株：通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或标志物称为 细胞株。 培养类型：细胞培养，组织培养，器官培养。 细胞生长的方式：贴附生长，悬浮生长 培养细胞的形态 （形态不一定， 环境改变形态可能改变） ：成纤维性型细胞， 上皮型细胞 （单 层膜样生长） ，游走性细胞（游散生长，常有伪足跟突起） 二． 培养过程及要点（切记无菌操作） （一） 工作环境的处理 实验进行前，无菌室及无菌操作台以紫外灯照射 30-60 分钟灭菌，以 70 % 酒精擦拭无 菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转 10 分钟后，才开始实验操作。每次操作只处理一 株细胞株， 且即使培养基相同亦不共享培养基， 以避免失误混淆或细胞间污染。 实验完毕后， 将实验物品带出工作台，以 70 % 酒精擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌操作台运转 10 分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。 实验用品以 70 %酒精擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在台面之中央无菌区域， 勿在边缘之非无菌区域操作。 无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞， 必要物品， 例如试管架、 吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。 小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在 打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约 45° 角取用， 尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。吸管口切勿碰到容器瓶口 工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病 毒 感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台 （至少Class II）。操作过程中， 应避免引起 aerosol 之产生，小心毒性药品，例如 DMSO 及 TPA 等，并避免尖锐针头之伤 害等。 定期检测下列项目： CO2 钢瓶之 CO2 压力 。 CO2 培养箱之 CO2 浓度、温度、及水盘是否有污染 （水盘的水用 无菌水， 每周更换 ）。 无菌操作台内之 airflow 压力，定期更换紫外线灯管及 HEPA 过滤膜， 预滤网 （300 小时 /预滤网， 3000 小时 /HEPA） 。 水槽可添加消毒剂 （Zephrin 1:750） ，定期更换水槽的水。 （二） 试验用玻璃塑料用品清洗及其消毒灭菌 清洗： （1） 玻璃器皿的清洗（酸液由重铬酸钾，浓硫酸，蒸馏水配置） 浸泡 —刷洗 —浸酸 —冲洗 （2） 胶塞的清洗 刚买回的常含滑石粉等杂质， 先用自来水冲洗后再按常规方法处理。 2%NaoH 或洗衣粉煮沸 10-20 分钟 ---1%稀 Hcl 浸泡 30 分钟或蒸馏水冲洗后再煮沸 10-20 分钟 —晾干备用 （3） 塑料制品的清洗 2%NaoH 浸泡过夜 —自来水冲洗 --5%稀 Hcl 浸泡 30 分钟—自来水和蒸馏水冲干备用。 消毒： （1） 物理消毒法（紫外线，湿热，烘干，过滤）含碳酸氢钠溶液要过滤，高压会分 解，培养液、平衡盐溶液及其它需要灭菌的液体： 121 C, 15磅，20分钟；布类、玻璃制品、 金属器械等物品：先 121 C , 15磅,20分钟，然后在烘箱中烘干；玻璃瓶：干热灭菌 170C , 4 小时。 （2） 化学消毒法（ 70%酒精，千分之一的新洁尔灭） （3） 抗生素：培养用液灭菌或预防培养物污染 （三）培养物的污染及控制 污染种类： （1 ） 细菌污染：培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混浊， pH 改变。污染后细 胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡。 （2） 真菌污染： 培养细胞受真菌污染后， 可见培养液中漂浮着白色或浅黄色的小点， 有的散在生长， 培养液一般不发生混浊； 倒置显微镜下可见丝状、 管状或树枝状的菌丝纵横 交错在细胞之间或培养基中，有的呈链状排列。 （3） 支原体污染： 培养细胞受支原体污染后， 部分敏感细胞可见细胞生长增殖变慢， 部分细胞变圆，从瓶壁脱落。但多数细胞污染后无明显变化，或略有变化，若不及时处理， 还会产生交叉污染。 （4） 病毒污染：尽管病毒污染的细胞不影响原代培养，但生产疫苗是不安全的。因 此，潜在病毒是细胞大量生产和疫苗、干扰素等生物制品制作中的难题。 （5） 非同种细胞污染： 污染来源： （1） 不洁的动物组织标本：正常情况下组织来源是不带菌的，但由于取材不