细胞的细菌、真菌污染及排除.docx

细胞的细菌、真菌污染及排除 Edit By Wait in g.D 真菌污染 是细胞培养 过程中最常见的一种， 尤其在梅雨季节进行 细胞培养 更易污染。污染培 养细胞的多为烟曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子霉、白念珠菌、酵母菌等。霉菌污染后多数在 培养液中形成白色或浅黄色漂浮物。一般肉眼可见，较易被发现，短期内培养液多不混浊， 倒置显微镜下可见于细胞之间纵横交错穿行的丝状、 管状、及树枝状菌丝，并悬浮飘荡在培 养液中。很多菌丝在高倍镜可见到有链状排列的菌珠； 念珠菌或酵母菌形态呈卵形， 散在细 胞周边和细胞之间生长。镜下看时，要将培养瓶用酒精棉球擦干净， 以防止与瓶外尤其瓶底 外面生长的菌丝相混淆。 真菌污染后，细胞生长变慢，但最后由于营养耗尽及毒性作用而使 细胞脱落死亡。 真菌污染 细菌是一种原核细胞微生物，其大小以微米（ ym）计。常见的污染细菌有革兰氏阴性 菌和大肠杆菌、假单胞菌等，革兰氏阴性菌中白色葡萄球菌等比较常见。 一旦发生细菌污染 较易发现，多数情况下培养液短期内颜色变黄， 表明有大量酸性物质产生， 出现明显混浊现 象；有时静置的培养液液体初看不混浊， 但稍加振荡，就有很多混浊物漂起。倒置显微镜下 观察，可见培养液中有大量圆球状颗粒漂浮。 必要时可取少量培养液涂片染色检查以证实细 菌种类；有的培养液改变不明显而又疑有污染， 可取出少量培养液用普通肉汤接种或用未加 双抗药物的培养液接种，也可取 10ml细胞悬液以100rpm 离心5min，沉淀中加入无抗 生素的培养液2ml，置于37 C培养，24h可得结果。污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒 增多、增粗，最后变圆脱落死亡，造成试验失败和细胞株 （系）丢失。 细菌污染 细菌和真菌污染多在传代、换液、加样等开放性操作之后发生，而且由于增生迅速，多 再发生污染48h以内就已明显。在实验的最初两天密切观察实验样品是否有污染发生，有 利于及时采取措施予以补救或排除。 培养细胞一经污染，多数较难处理。如果污染细胞价值不大，宜弃之；有细胞株留存的 或可购置的，可在寻找原因后彻底消毒操作室和二氧化碳 培养箱（若发现真菌污染，可在污 染孔内加入1mol/L氢氧化钠或硫酸铜溶液处理）（具体操作方法可参考 细胞培养 污染的预 防），复苏或重新购置细胞，再培养。若污染细胞价值较大，又难于重新得到，可采用 5? 10倍于常用量的抗生素冲击， 加入高浓度抗生素后作用 24?48h ,再换入常规培养液， 有 时可能奏效。细胞培养 中常用的抗生素及用量见下表。 常用抗生素用量和效应 抗生素 抗菌谱 浓度（量/mL） 细菌 真菌 支原体 青霉素 G+ 100?1000U 链霉素 G- 100 ?1000g 庆大霉素 G+ /G- + 50 ?200 i g 四环素 G+ /G- + 10?50 i g 卡那霉素 G+ /G- + 100 ?1000 i g 两性霉素 + 常用21 g/mL 制霉菌素 + 常用 25 i g/mL +表示效应程度 高浓度的抗生素和抗霉菌素可能对一些细胞系有毒性，因而，做剂量反应实验确定抗生 素和抗霉菌素产生毒性的剂量水平。这点在使用抗生素如两性霉素 B和抗霉菌素如泰乐菌 素时尤其重要。下面是推荐的确定毒性水平和消除培养污染的实验步骤。 在无抗生素的培养基中消化、计数和稀释细胞，稀释到常规细胞传代的浓度。 分散细胞悬液到多孔培养板中， 或几个小培养瓶中。 在一个浓度梯度范围内， 把选择抗生 素加入到每一个孔中。 例如，两性霉素B推荐下列浓度，0.25 , 0.50 , 1.0 , 2.0 , 4.0,8.0 mg/ml 。 每天观测细胞毒性指标，如脱落，出现空泡，汇合度下降和变圆。 确定抗生素毒性水平后，使用低于毒性浓度 2?3倍浓度的抗生素的培养液培养细胞 2 3代。 在无抗生素的培养基中培养细胞一代。 重复步骤4。