实验动物肝脏DNA提取.pptVIP

8.凝胶板的制备： （1）取琼脂糖0.7 g，加1×TBE缓冲溶液100ml，于沸水浴中至熔化，制成0.7%的琼脂糖胶液。 （2）胶床两头贴上防水胶带，形成8mm高的挡墙，压紧胶带，置水平台面上。 （3）插入梳子，梳齿下端离板底0.5－1mm。 （4）在胶床上滴加2－3滴 0.5μg/mL的EB溶液。 （5）将60℃凝胶不间断倒入胶床，高3－4mm，避免气泡，摇匀，室温下凝固。 （6）完全凝固后，撕掉胶带，置于电泳槽中，加入电泳缓冲液，高于胶面1－2mm，从一头轻轻斜拉出梳子，除去产生的气泡。 9.加样： 将样品DNA溶液与加样缓冲液以5 ：1的体积比混合，用微量移液器加样，每加完一个样品，冲洗三次。加样量15～20 ?l （加样时应防止碰坏样品孔周围的凝胶面以及穿透凝胶底部）。 10.电泳： 为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率，电场强度不应高于5V/cm（两电极间的距离）开始时用较高电压(80V)，样品一进入胶内则将电压调至5V/cm 。当染料前沿移至底边1-2mm时，电泳毕。 11. 观察 关闭电源，取出胶床，在紫外检测仪下观察凝胶中的DNA（红橙色荧光）。 五、思考题： 1、用荧光染料EB染色的原理和优缺点是什么？ 2、绘制DNA电泳图谱。 核酸提取过程中的注意事项： （1）避免过酸过碱或高温环境，合适的T：0－4℃， pH4-9； （2）防止机械力的切割作用，避免剧烈振荡； （3）防止核酸酶的降解作用，可加入抑制剂－EDTA，柠檬酸钠； （4）整个操作步骤应尽量简化，缩短实验过程，减少核酸变性、降解、机械切割的机会。 实验 动物肝脏DNA提取 二、实验原理: 要获得纯的DNA样品，必须考虑以下几点： 如何选材，如何破碎组织细胞？ 如何除去蛋白质？(在真核细胞内，DNA与蛋白质结合成核蛋白的形式存在。因此，分离DNA时必须使其与蛋白质解离，并除去蛋白质。) 设法除去RNA的污染； 防止DNA酶的降解作用； （一）动物肝脏DNA制备原理 选 材 要提取动物组织DNA，一般选择细胞膜较脆弱，容易破碎的动物脏器，如胸腺、肝脏、脾脏、胰脏等。 研磨：将剪碎的动物组织置于研钵或匀浆器中，加入少量石英砂研磨或匀浆，破碎细胞。这种方法温和，适合实验室使用。 组织捣碎器：较剧烈的破碎细胞的方法，为了防止发热和升温过高，通常是转10秒—20秒，停10秒—20秒，可反复多次。 压榨法：在1000×105Pa—2000×105Pa 的高压下使几十毫升的细胞悬液通过一个小孔突然释放至常压，细胞将彻底破碎。温和的、彻底破碎细胞的方法，但仪器费用较高。 细胞破碎方法—机械物理法： 反复冻融法：将待破碎的细胞冷至－15℃到－20℃，然后放于室温(或40℃)迅速融化，由于细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎。 超声波处理法：借助超声波的振动力破碎细胞壁和细胞器。使用时注意降温，防止过热。 冷热交替法：在90℃左右维持数分钟，立即放入冰浴中使之冷却，如此反复多次，绝大部分细胞可以被破碎。 细胞破碎方法—机械物理法 细胞破碎方法—化学方法 有机溶剂处理法：利用氯仿、甲苯等脂溶性溶剂或SDS（十二烷基硫酸钠）等表面活性剂处理细胞，可将细胞膜溶解，从而使细胞破裂，此法也可以与研磨法联合使用。 溶胀法：细胞膜为天然的半透膜，在低渗溶液和低浓度的稀盐溶液中，由于存在渗透压差，溶剂分子大量进入细胞，将细胞膜胀破释放出细胞内含物。 (三)除去RNA的方法 脱氧核糖核蛋白在浓NaCl（1-2mol／L）溶液中溶解度很大，但在0.14mol／L NaCl溶液中溶解度很低，而核糖核蛋白则溶于0.14mol／L NaCl溶液中，利用这一性质可将脱氧核糖核蛋白与绝大部分核糖核蛋白分离开来。 (四)除去蛋白质的方法 用氯仿一异戊醇混合液振荡核蛋白溶液，使蛋白质变性，然后离心除去变性蛋白质，此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA溶于上层水相。用两倍体积 95％乙醇溶液可将DNA钠盐沉淀出来。 用十二烷基硫酸钠（SDS）等去污剂使蛋白质变性，可以直接从生物材料中提取DNA。 纯的DNA样品的获得 为了防止DNA酶的降解，提取时可加入适量EDTA（乙二胺四乙酸）、柠檬酸，以降低DNA酶的活性。 加入RNA酶降解剩余的RNA，获得纯的DNA。 保存：将DNA于滤纸上干燥，溶于1mlTE中低温保存。 　　（二）琼脂糖凝胶电泳分离核酸的原理： 琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖凝胶作为支持介质的一种电泳分离方法，是一种简便、快速分离鉴定核酸的方法，已成为分子生物学及基因工程研究中常用实验方法之一。 琼脂糖英文名agarose，是从琼脂中提取出来的，由半乳糖和3.6-脱