实验21动物肝脏DNA提取.pptVIP

8.凝胶板的制备： （1）取琼脂糖0.7 g，加1×TBE缓冲溶液100ml，于沸水浴中至熔化，制成0.7%的琼脂糖胶液。 （2）胶床两头贴上防水胶带，形成8mm高的挡墙，压紧胶带，置水平台面上。 （3）插入梳子，梳齿下端离板底0.5－1mm。 （4）在胶床上滴加2－3滴 0.5μg/mL的EB溶液。 （5）将60℃凝胶不间断倒入胶床，高3－4mm，避免气泡，摇匀，室温下凝固。 （6）完全凝固后，撕掉胶带，置于电泳槽中，加入电泳缓冲液，高于胶面1－2mm，从一头轻轻斜拉出梳子，除去产生的气泡。 实验21 动物肝脏DNA提取 二、实验原理: 要获得纯的DNA样品，必须考虑以下几点： 如何选材，如何破碎组织细胞？ 如何除去蛋白质？(在真核细胞内，DNA与蛋白质结合成核蛋白的形式存在。因此，分离DNA时必须使其与蛋白质解离，并除去蛋白质。) 设法除去RNA的污染； 防止DNA酶的降解作用； （一）动物肝脏DNA制备原理 选 材 要提取动物组织DNA，一般选择细胞膜较脆弱，容易破碎的动物脏器，如胸腺、肝脏、脾脏、胰脏等。 研磨：将剪碎的动物组织置于研钵或匀浆器中，加入少量石英砂研磨或匀浆，破碎细胞。这种方法温和，适合实验室使用。 组织捣碎器：较剧烈的破碎细胞的方法，为了防止发热和升温过高，通常是转10秒—20秒，停10秒—20秒，可反复多次。 压榨法：在1000×105Pa—2000×105Pa 的高压下使几十毫升的细胞悬液通过一个小孔突然释放至常压，细胞将彻底破碎。温和的、彻底破碎细胞的方法，但仪器费用较高。 细胞破碎方法—机械物理法： 反复冻融法：将待破碎的细胞冷至－15℃到－20℃，然后放于室温(或40℃)迅速融化，由于细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎。 超声波处理法：借助超声波的振动力破碎细胞壁和细胞器。使用时注意降温，防止过热。 冷热交替法：在90℃左右维持数分钟，立即放入冰浴中使之冷却，如此反复多次，绝大部分细胞可以被破碎。 细胞破碎方法—机械物理法 细胞破碎方法—化学方法 有机溶剂处理法：利用氯仿、甲苯等脂溶性溶剂或SDS（十二烷基硫酸钠）等表面活性剂处理细胞，可将细胞膜溶解，从而使细胞破裂，此法也可以与研磨法联合使用。 溶胀法：细胞膜为天然的半透膜，在低渗溶液和低浓度的稀盐溶液中，由于存在渗透压差，溶剂分子大量进入细胞，将细胞膜胀破释放出细胞内含物。 (三)除去RNA的方法 脱氧核糖核蛋白在浓NaCl（1-2mol／L）溶液中溶解度很大，但在0.14mol／L NaCl溶液中溶解度很低，而核糖核蛋白则溶于0.14mol／L NaCl溶液中，利用这一性质可将脱氧核糖核蛋白与绝大部分核糖核蛋白分离开来。 (四)除去蛋白质的方法 用氯仿一异戊醇混合液振荡核蛋白溶液，使蛋白质变性，然后离心除去变性蛋白质，此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA溶于上层水相。用两倍体积 95％乙醇溶液可将DNA钠盐沉淀出来。 用十二烷基硫酸钠（SDS）等去污剂使蛋白质变性，可以直接从生物材料中提取DNA。 纯的DNA样品的获得 为了防止DNA酶的降解，提取时可加入适量EDTA（乙二胺四乙酸）、柠檬酸，以降低DNA酶的活性。 加入RNA酶降解剩余的RNA，获得纯的DNA。 保存：将DNA于滤纸上干燥，溶于1mlTE中低温保存。 　　（二）琼脂糖凝胶电泳分离核酸的原理： 琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖凝胶作为支持介质的一种电泳分离方法，是一种简便、快速分离鉴定核酸的方法，已成为分子生物学及基因工程研究中常用实验方法之一。 琼脂糖英文名agarose，是从琼脂中提取出来的，由半乳糖和3.6-脱水-L- 半乳糖相互结合的链状多糖。琼脂糖和琼脂都可在不同浓度的水溶液下可形成多孔的凝胶，电泳中具有分子筛效应。但琼脂糖含硫酸根比琼脂少，电渗作用降低，因而分离效果明显提高。 DNA分子在pH高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动（电荷效应） 。 DNA分子泳动速率的大小除与DNA分子的带电量有关外，还与DNA分子的大小和空间构象有关（琼脂糖凝胶的分子筛效应）。 电泳时，用溴酚蓝做前沿指示剂，用溴化乙啶 （ethidium bromide，EB） 指示DNA样品在凝胶中的确切位置。 溴化乙啶是一种荧光染料，可插入DNA双螺旋结构的两个碱基对之间，与DNA分子形成络合物，在紫外光的激发下发出橙黄色的荧光。 荧光来自两方面，一是核酸吸收260nm的紫外光，并将能量传给EB；二是EB本身吸收波长为302nm和360nm的紫外光。这两方面的能量最终激发EB发出波长为590nm的红橙色荧光。 溴化乙啶可加入凝胶中，也可以在电泳后，将凝胶放在含EB的溶液中浸泡. 溴化乙啶检测DNA的灵敏度很高，可检出10n