烟草瞬时转化实验步骤.docxVIP

烟草叶片瞬时转化实验 试验方法 一、 实验材料及药品 pCAMBIA 1381Z-Luc载体、Gv3101农杆菌菌株及其感受态、MES、MgCI2、 乙酰丁香通、5-6周本氏烟草等 二、 载体构建及农杆菌转化 烟草瞬时转化实验选用融合 Luc信号的pCAMBIA 1381Z-Luc载体，载体构 建过程是将拟南芥及菊花的FT启动子分别采用双切双连的常规载体构建方式将 启动子构建到pCAMBIA 1381Z-Luc载体上，同时将目的基因构建到pMDC43或 PMDC32或pORE载体上作为超表达载体进行后续的瞬时转化实验。 通过农杆菌转化的方式，将上述构建好的质粒转化到农杆菌菌株 GV3101的 感受态细胞中。 三、 材料的准备 1、 烟草植株5-6周幼嫩未开花植株 2、 携带质粒的农杆菌（GV3101或An 105均可） 3、YEB培养液（一瓶+K+R、一瓶只+R——pCAMBIA 1381Z-Luc载体为卡纳氯 霉素抗性、Gv3101只有r抗性） 4、处理液：10mL配方如下 4、处理液：10mL配方如下 母液配方（10ml配方）: 0.5M MES 200ul 0.976g 1M MgCl2 1M MgCl2 100ul 100mM乙酰丁香酮 10ul 2.03g 0.196g （使用DMSO溶解） 灭菌水加至10ml （若长时间保存，需避光！） 四、操作步骤 1、 农杆菌转化 2、 转化正确的农杆菌进行过夜培养，同时培养 P19菌株（最好先进行划线） 3、 确定不同农杆菌所加菌液的量： 计算公式：V=nXVfinal 区.5/OD600 VP19= nXVfinal 区.3/OD600 OD600最好在1以上 n=注射叶片数 Vfinal=悬浮后的终体积多为2ml或3ml 注：在进行转录激活或抑制实验时，一般加入四种农杆菌（包括 P19）而对 照组往往只加入两种或三种菌液，此时，应使用 Gv3101对体系进行补充，计算 方法为公式一，具体加入量视对照组缺失的量确定，分别加入一倍或两倍Gv3101 进行补充。 4、 将计算出的各菌液体积进行混匀（此时各菌液实际浓度比例为 1:1:1 ）， 5000rpm，5min5、弃上清，用Vfinal （2ml或3ml ）悬浮液进行悬浮，随后室温 避光放置3h 利用无针头注射器注射叶片（先用针头在叶片上扎一个小孔）（注射烟草顶端 以下第3-5片叶片） 7、 暗培养1d，转入光照培养1-2d 8、 利用稀释好的荧光素酶底物喷施到叶片上， 黑暗下放置1-2min，随后利用CCD 冷冻相机进行观察。 荧光素酶的配置：固体0.032g溶解于1ml灭菌水中，用前吸取该溶液100ul 稀释到10ml水中，并加入10ul Triton-X-100 （全程避光）。