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实验十 50L 发酵罐的使用—发酵过程与控制 生物反应器是生物工程的重要组成部分，是生物技术转化为产品的关键设备，在生物工程中处于中心地位。机械搅拌式生物反应器，又称发酵罐，是进行 液体发酵的特殊设备。实验室使用的小型发酵罐，其容积可从 1 L 至数百升。发酵罐配备有控制器和各种电极， 可以自动地调控试验所需的培养条件， 是微生物学、遗传工程、医药工业等科学研究所必需的设备。一、实验目的 认识全自动生物反应器的安装和准备， 反应后的拆卸和清洗等； 分别了解 pH 电极和溶氧电极（ DO）的结构和基本原理；掌握 pH电极和溶氧电极的校正方法；认识发酵罐培养基的灭菌， 认识反应器在位高压灭菌的方法和规程， 学会对反应器培养液灭菌过程中的升温、 保压、降温和培养温度的设定等的操作； 掌握接种的方法及操作，确保发酵液无杂菌污染； pH调节剂、消泡剂以及补料的连接方法；学会从反应器中定时取出样液的方法； 学会如何进行参数控制； 并掌握正确使用先进反应器发酵生产的方法， 从而可对中试及中试以上的发酵生产研究有一个初步的概念和感性认识。 二、实验原理 （一）安装和拆卸： 反应器为碟形，上盖可以自动起降，它与罐体是通过橡皮垫圈和螺栓密封的。盖上设有搅拌电机、搅拌轴、机械密封及其多个接口（接种口、空气进口、尾气出口、各种检测仪表的插孔、消泡剂和酸碱液注入口、补料口、备用口、压力表等）；罐体设有夹套层，用以加热或冷却，罐内有搅拌桨叶、档板、空气分布器；中部侧面装有温度传感器及溶氧电极和 pH电极插口以及取样口。与罐体连接的部分布有无菌空气系统，并配备一台自动调控装置。整个装置处于工作状态时，必须保持无菌状态，而操作结束后，必须移走培养液，并进行清洗罐体等。因此必须进行安装和拆卸步骤。 （二） pH电极的校正 待校正的 pH 电极是由氯化银参比电极和玻璃电极组合在一起的复合玻璃电 极。复合电极的内层玻璃管与玻璃球泡相通， 内充以恒定 pH 植的标准缓冲溶液， 从中引出氯化银电极导线，组成玻璃电极（即指示电极） 。在外层玻璃管引入银 1 丝，其表面覆盖一层 AgCl 薄膜。从上部扩大部分边上的注液口加入饱和氯化钾溶液，就形成氯化银电极，在外玻璃管的下部，开有一小口，装有多孔陶瓷芯， 使 KCl 溶液可稍许向外溶液渗漏，即所谓液络部。复合电极的基本性能参数有电极转换系数（也称 Nernst 斜率），电极零电位，电极内阻，参比电阻，电极响应时间，耐高温冲击的次数等等， 它们都有一定的要求和测试方法， 对新使用的 电极或已经发酵运行一段时间的电极， 其性能参数要发生变化， 对某些性能参数要进行测定，决定是否可投入使用。 复合玻璃电极的构造 （三）溶氧电极的校正 电解型电极是由一个阴极（贵重金属如铂或金） 、一个阳极（ Ag/AgCl ）和一种电解质，如中性 NaCl 溶液组成的。在某一溶氧浓度一定的溶液系统中，通过电极之间约 0.6~0.8 的电压，使溶解氧在阴极上被还原， 从电极的电流 ~电压极谱图（图 3）可以看出， OA 为极谱残余电流； A 点为氧的分解电压，当外加电 压大于分解电压 A ，这时电极输出电流Ⅰ随着电压增大而增加，当达 B 点后， 电极电流就不再随着外加电压而增加，即电极电压进入恒 2 扩散电流与氧浓度的关系 定区，这时称为饱和电流或扩散电流。当外加电压继续增至 C 点时，电极输出 电流迅速增加， 这是由于水被还原成氧所造成的。 从图中也可看出饱和电流与溶 氧浓度成正比关系。 因此，只要把外加电压固定在电流电压图中的平坦部分， 电 极输出电流就可以校正测量溶解氧，这个固定电压常选在 0.6～0.8V 之间。 反应式为： 阴极： O2 2 - → 2 2 - + 2H O +2e H O + 2OH H2O2 +2e- → 2OH- 阳极： Ag +Cl - → AgCl + e- 总反应： 4Ag + O2 + 2H2O + 4Cl- → 4AgCl + 4OH - 用 NaCl 或 KCl 作为电解质，电解质在使用过程中被消耗，必须在一段时间后补充。 溶氧探头的结构 （四）反应器培养液的灭菌与接种培养 生物反应器的灭菌是采用夹套层蒸汽预热后直接或间接通入饱和蒸汽灭菌 的方式进行的，可将反应器内培养液的温度升至 121℃，以达到灭菌的效果，灭菌后的培养基冷却至培养温度后， 即可接种培养。 接种时，严格按照无菌操作进行，避免杂菌污染。 3 （五）补料、取样 生物反应器的补料（酸碱、消泡剂及其它营养液）可通过蠕动泵进行补加， 可自动也可手动； 取样是了解发酵过程的重要手段， 取样时，严格按照无菌操作 进行，避免杂菌污染。 三、实验步骤： （一）首先拧下螺栓， 启动自动升降机打开上盖， 检查培养罐内部是否清洗干净。插入校