第章酶免疫技术.ppt

第三节 酶联免疫吸附试验 底物显色 定性或定量的分析 原理 包被 反应 加入待测抗体或 抗原和酶标抗原 或抗体 洗涤 使结合在固相上 的抗原抗体复合物 与未结合的分离 1 2 3 4 一、基本原理 固相的抗原或抗体 酶标记物（酶结合物 ） 酶反应的底物 三个必要试剂 二、方法类型及反应原理 双抗体夹心法 ? 方法： 用已知抗体包被，加入待检血清，再加酶 标抗体，加底物显色 ? 应用： 二价或二价以上的较大分子抗原测定 乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、 HCG 等 ELISA 检测抗原的方法 双抗体夹心法测抗原 + - E E E E E E E E E 竞争法 方法： 用已知抗体包被，加入待测血清，再加酶标抗 原，酶标抗原与待检物竞争与包被物结合。加底物显色 。 应用： 用于只有一个抗原决定簇的小分子半抗原（药 物、激素等） ELISA 检测抗原的方法 章酶免疫技术 节 酶免疫技术的特点 一、酶和酶作用底物 二、酶标记抗体或抗原 三、固相载体 第二节酶免疫技术的分类 一、均相酶免疫测定 二、非均相酶免疫测定 第三节 酶联免疫吸附试验 一、基本原理 二、方法类型及反应原理 思考题 小结 放 射 免 技 术 发 光 免 技 术 酶 免 技 术 三大经典标记技术 三大经典标记技术 第一节 酶免疫技术的特点 ? 主要试剂 : 酶标记的抗体或抗原 ? 酶标物特点： 免疫学活性 酶对底物的催化活性 抗原抗体反应的特异性 + 酶高效催化反应的专一性 原理及特点 特点： ? 灵敏度高、特异性强、 准确性好 ? 酶标记试剂能够较长时 间保持稳定 ? 操作简便、对环境没有 污染。 ? 易与其它技术偶联 衍生出适用范围更广的 新方法 。 原理： ? 酶标抗体（抗原）与抗原 （抗体）的特异性反应 ? 酶对底物的显色反应 ? 对抗原或抗体进行定位、 定性或定量的测定分析 原理及特点 标记酶的要求： 活性高 性质稳定 专一性强 酶催化底物的显色信号易于判断和测量 方法敏感，重复性好，简单易行 酶的底物易于配制保存，酶及底物价廉 一、酶和酶作用底物 辣根过氧化物酶（ HRP ） 糖蛋白（主酶） 亚铁血红素（辅基） 主酶与酶活性无关 辅基是酶的活性中心 纯度用 RZ( 纯度数 ) 值： 403nm （辅基） 与 275nm （主酶） OD( 吸光度 ) 值之比 RZ 值与酶活性无关， 酶活性单位 U 比 RZ 值更为重要 ELISA 中应用最为广 泛的标记用酶 常用酶 酶和酶作用底物 优点 ? 容易提取 ? 价格低廉 ? 性质稳定，耐热，与抗原抗体偶联后活 性很少损失 碱性磷酸酶（ AP ） 菌源性 AP 肠粘膜 AP β –半乳糖苷酶（ β -Gal ） 用于均相酶 免疫测定 常用酶 酶和酶作用底物 HRP 的底物 DH 2 +H 2 O 2 → → → D+2H 2 O HR P 供氢体 DH 2 习惯上被称为底物，底物有多种 H 2 O 2 为受氢体， HRP 对受氢体的专一性很 高 常用底物 酶和酶作用底物 HRP 的常见底物 邻苯二胺 OPD 四甲基联苯胺 TMB 5- 氨基水杨酸 5-ASA 2,2′ - 氨基 - 二 (3- 乙基 - 苯并噻 唑啉磺酸 -6) 铵盐 ABTS 常用底物 酶和酶作用底物 OPD 反应后显橙 黄色，加酸终止 反应后呈棕黄色， 测定波长 492nm 。 不稳定，致癌性。 TMB 反应后显蓝色 ， 加酸终止反应后变 为黄色 , 测定波长 450nm ，稳定，无 致癌性， ELISA 中 应用最广泛的底物。 HRP 的常见底物 酶和