DB13∕T 2609-2017 禽流感病毒与新城疫病毒二重RT-PCR检测方法(河北省).pdfVIP

2017 - 11 - 22 发布 2017 - 12 一 22 实施 发布 河北省质量技术监督局 悖。 ;升飞二 111 飞 户 伽 / 飞 \ 、 0813/ T 2609--2017 禽流感病毒与新城疫病毒二重 RT-PCR 检测方法 1 范围 本标准规定了禽流感病毒与新城疫病毒RT-PCR检测方法的技术要求。 本标准适用于检测家禽咽喉拭子、 u拭子，发病禽组织和这些采集样品培养物中的禽流感病毒与 新城疫病毒。 2 ;宿略语 下列缩略语适用于本文件。 EB: 澳化乙链 ( e thidium bromide) DEPC: 焦碳酸、二乙酶 (diethypyrocarbonate) PCR: 聚合酶链式反应 ( polymerase chain reac t ion) RNA: 核糖核酸 (ribonucleic acid) RT-PCR: 反转录一聚合酶链式反应 (reverse-transcription polymerase chain reac t ion) dNTP: 脱氧核昔酸三磷酸 (deoxy-ribonucleoside triphosphate) 3 试剂或材料 包括LS TRIzol RNA提取试剂或各种市住病毒核酸提取试剂盒，氯仿，异丙醇， 75%乙醇， 1. 0%琼 脂糖凝胶， 50XTAE缓忡液，澳化乙链 (EB ， 10 ug/μL)或核酸染料，焦碳酸二乙酣 (DEPC) 处理的 灭菌的双蒸水， DNA分子主标准(100 b抖， 2汀aq Mast erMixo 警示:氯仿属中等青性i 在操作中应在通风条件下进行，使用时戴手套不口口罩，不小心沾到皮肤应 立即冲洗:电泳中用到的EB在操作中应戴于套和口罩。试验中被EB污染的物品要进行无害化处理; DEPC 在操作中应在通风条件下进行，使用时藏于套和口罩，不小心拍到皮肤应立即忡洗。 3. 1 LS TRIzol RNA 提取试剂或病毒核酸捉取民剖盒r 3. 2 氯仿:又名三氯甲:院。 3.3 1. 0%琼脂糖凝胶，配制方法见附录A 中 A. 1o 3.4 50XTAE 缓冲液，配制方法见附录A 中 A.20 3. 5 漠化乙绽 (EB ， 10 ug/IJ L)或核酸染料，配制方法见附录 A 中 A.3 0 3. 6 焦碳酸二乙酣 (DEPC) 处理的灭菌的双蒸水，配制方法见附录A 中 A.4o 3. 7 DNA 分子量标准 000 bp) 包含 100 bp、 250 bp、 500 bp、 750 bp、 1000 bp 、 2000bp 几种分 子量标准。 3. 8 反转录酶:M-MLV 反转录酶 (200 U/ IJ L)戚朋V 反转录酶(10 U/ IJ L)。 DB13/ T 2609--2017 3. 9 RNA 酶抑制剂。 3. 10 2 X Taq MasterMix: 含有 PCR 缓冲液、酶混合物、 dNTP 泪合物、无RNA 酶的水等。 3.11 dNTP。浓度为 2. 5mMo 3. 12 引物:反转录引物、上游引物与下游引物见附录B 中的表8. 10 引物浓度为 10 j.J mo l/L 。 4 仪器设备 4. 1 PCR 仪:温度范围 4. OC~gg. g C ，样品基座配置至少包括单个 0.2 mL 孔。 4. 2 凝胶成像系统:检测灵敏度 DNA 二三 O.lng; 有效像数 1360 X 1024、 10 bit 、 USB 2.0 。 4. 3 台式低温高速离心机:最高转速 16000 r/min; 容量1. 5 mL