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组织培养实验指导书 实验一 组培器皿及器械的洗涤、灭菌及环境的消毒 一、实验目的 通过实验 使学生了解并掌握组织培养用实验器皿及器械的洗涤、灭菌 环 境的消毒方法。 二、实验原理 实验仪器及器械的清洗、消毒和灭菌是组织培养成功的关键所在 是外植体 免受污染的前提。由于灭菌剂的种类不同 所以选择消毒剂既要考虑良好的消毒、 杀菌作用，同时易被蒸馏水冲洗掉。 无菌的环境是植物组织培养成功的前提 因为绝大多数操作程序要求在无菌 条件下进行。 三、实验操作步骤 （一）器皿与用具的洗涤 1、玻璃器皿的洗涤 新购置的玻璃器皿或多或少都含有游离的碱性物质。使用前要先用 1%稀 HCL 浸泡一夜，再用肥皂水洗净，清水冲洗后 再用蒸馏水冲洗 1 次，晾干后备用。 用过的玻璃器皿，用清水冲洗，蒸馏水冲洗一次，干后备用即可。 对于已被污染的玻璃器皿则必须在高压蒸汽灭菌后 倒去残渣 用毛刷刷去 瓶壁上的培养液和病斑后 再用清水冲洗干净 蒸馏水冲淋一遍 晾干备用 切 忌不可用水直接冲洗 否则会造成培养环境的污染。清洗后的玻璃器皿 瓶壁应 透明发亮，内外壁水膜均一，不挂水珠。 2、金属用具的洗涤 新购置的金属用具表面上有一层油腻 需擦净油腻后再用热肥皂水洗净 清 水冲洗后，擦干备用。用过的金属用具，用清水洗净，擦干备用即可。 3、每人清洗部分玻璃器皿 清水洗净→浸入洗衣粉溶液中洗刷→清水反复冲洗→蒸馏水淋一遍→烘干 备用。 对于较脏玻璃器皿的洗涤：采用先碱后酸的方法，即用洗衣粉洗刷后冲洗干 净→晾干→浸入酪酸洗液 （一种强氧化剂 去污能力强 配制方法：重铬酸钾 40 克 溶解在 500ml 在水中 然后徐徐加入 450ml 粗制浓硫酸） 浸泡时间视器皿 的肮脏程度而定→清水反复冲洗干净→蒸馏水淋洗一遍→烘干备用。 第 0 页第 0 页第 0 页 组织培养实验指导书 对于带有石蜡或胶布的器皿：先将其除去，再用常规洗涤，石蜡用水煮沸数 次即可去掉 胶布粘着物则需用洗衣粉液煮沸数小时 再用水冲洗 凉干后浸入 洗液，以后的步骤同前。 （二）玻璃器皿、用具及环境的灭菌 1、玻璃器皿和用具的灭菌 （1）采用干热灭菌法： 将洗干净晾干后的培养皿、三角瓶、吸管等玻璃用具和解剖针、解剖刀、镊 子等金属器具 用纸包好 放进电热烘干箱 当温度升至 100℃时 启动箱内鼓 风机 使电热箱内的温度均匀。当温度升至 150℃时 定时控制 40min （或 120℃ 定时 120min）,达到灭菌目的。 （2）采用高压蒸汽灭菌法： 即用手提式高压灭菌锅 在 1.2 个大气压下保持 15～20 分钟。有些如聚丙 烯、聚甲基戊烯等类型的塑料用具也可以进行高温消毒。 （3）灼烧灭菌： 用于无菌操作的镊子、解剖刀等用具除高压蒸汽灭菌外 在接种过程中还常 常采用灼烧灭菌 将镊子、解剖刀等从浸入 95%酒精中取出 置于酒精灯火焰上 灼烧，借助酒精瞬间燃烧产生高热来达到杀菌等目的。操作过程中要反复浸泡、 灼烧、放凉、使用，操作完毕后，用具应擦拭干净后再放置。 2、环境的消毒 （1）地面、墙壁和工作台的灭菌 每次使用前 将配好的 20%新洁尔灭（苯扎溴铵）溶液倒入喷雾器中，对接 种室地面、墙壁、角落均匀地喷雾。在喷房顶时间，注意不要让药液滴入眼睛。 然后开启紫外灯开关 照射 15～30min 一般紫外线消毒后不要立即进入 应在 关闭紫外灯 15-20min 后进入室内。 （2）无菌室和培养室的灭菌 消毒灭菌的方法：首先将房子关闭 定期用甲醛和高锰酸钾 2：1 的比例定 期熏蒸灭菌 24h 或用 70%的酒精或 0.5%苯酚喷雾降尘和消毒。操作时要戴好口罩 和手套 用甲醛与高锰酸钾配比时要注意避开烟雾 封闭消毒期间不宜进入消毒 空间。 三、 实验报告 1．将本次实验内容整理成实验报告。 2. 试阐述为什么要对器皿和用具进行严格的洗涤和灭菌？