微生物应用基础 显微镜直接计数法 学习手册-显微镜直接计数法.docVIP

学习手册 《子情境：显微镜直接计数法》 引导文-单元设计-技能考核标准-实训指导书 子情境：引导文 微生物生长量的测定 ——显微镜直接计数法 阅读材料 阅读材料 材料一：微生物生长量的测定方法 研究微生物生长的对象是群体，那么测定微生物生长繁殖的方法既可以选择测定细胞数量，也可以选择测定细胞生物量。既然生长意味着原生质含量的增加，所以测定生长的方法也都直接地以此为根据，而测定繁殖则都要建立在计数这一基础上。 （一）细胞数量的测定 1.稀释平板菌落计数法 这是一种最常用的活菌计数法。在大多数的研究和生产活动中，人们往往更需要了解活菌数的消长情况。从理论上讲，在高度稀释条件下每一个活的单细胞均能繁殖成一个菌落，因而可以用培养的方法使每个活细胞生长成一个单独的菌落，并通过长出的菌落数去推算菌悬液中的活菌数，因此菌落数就是待测样品所含的活菌数。此法所得到的数值往往比直接法测定的数值小。 稀释平板计数法可分为两种方法：一种是涂布法；另一种是倾注法。涂布平板法是将一定体积样品菌液稀释后取一定量涂布于平板表面，在最适条件下培养后，从平板上出现的菌落数乘以菌液的稀释度，即可算出原菌液的含菌数。 倾注法是将经过灭菌冷却至45～50℃的琼脂培养基与稀释后一定量的样品在平皿中混匀，凝固后进行培养，然后进行计数。这种方法在操作时有较高的技术要求。其中最重要的是应使样品充分混匀，并让每支移液管只能接触一个稀释度的菌液。有人认为，对原菌液浓度为109个/mL的微生物来说，如果第一次稀释即采用10-4级（将10μL菌液加至100mL无菌水中），第二次采用10-2级（吸lmL上述稀释液至100mL无菌水中），然后再吸此菌液0.2mL进行表面涂布和菌落计数，则所得的结果最为精确。其主要原因是一般的吸管壁常因存在油脂而影响计数的精确度（有时误差竞高达15% 2.血球计数板法 血球计数板是一块特制的载玻片，计数是在计数室内进行的，即将一定稀释度的细胞悬液加到固定体积的计数器小室内，在显微镜下观测小室内细胞的个数，计算出样品中细胞的浓度，稀释浓度以计数室中的小格含有4～5个细胞为宜。由于计数室的体积是一定（0.1mL）的，这样可根据计数出来的数字算出单位体积菌液内的菌体总数。但一般情况下，要取一定数量的计数室进行计数，在算出计数室的平均菌数后，再进行计算。这种方法的特点是测定简便、直接、快速，但测定的对象有一定的局限性，只适合于个体较大的微生物种类，如酵母菌、霉菌的孢子等；此外测定结果是微生物个体的总数，其中包括死亡的个体和存活的个体，要想测定活菌的个数，还必须借助其它方法配合。 3.比浊法 细菌培养物在其生长过程中，由于原生质含量的增加，会引起培养物混浊度的增高。最古老的比浊法是采用MoFarland比浊管。这是用不同浓度的BaCl2与稀H2SO4配制成的10支试管，其中形成的BaSO4有10个梯度，分别代表10个相对的细菌浓度（预先用相应的细菌测定）。某一未知浓度的菌液只要在透射光下用肉眼与某一比浊管进行比较，如果两者透光度相当，即可目测出该菌液的大致浓度。 如果要作精确测定，则可用分光光度计进行。在可见光的450~650nm波段内均可测定。为了对某一培养物内的菌体生长作定时跟踪，可采用不必取样的侧壁三角烧瓶来进行。测定时，只要把瓶内的培养液倒入侧臂管中，然后将此管插入特制的光电比色计比色座孔中，即可随时测出生长情况，而不必取用菌液（图3-1）。 图3-1 测定生长用的侧臂三角烧瓶 1-侧臂试管三角烧瓶；2-侧臂试管；3-侧臂试管插座；4-比色架面板； 5-连接螺丝；6-比浊测定透光窗；7-光路开关孔；8-比色架底板 以上介绍了若干测定微生物的生长量或计算繁殖数的主要方法。其中，最常用的为称干重、测浊度（用分光光度计）用计数板测总菌数以及用平板菌落计数法测活菌数等方法。必须指出的是，不管用什么方法，都有其优缺点和使用范围。所以，在使用前，一定要根据自己的研究对象和研究目的的不同，选用最合适的方法。 （二）细胞生物量的测定 1.称干重 可用离心法或过滤法测定，一般干重为湿重的10%~20%。在离心法中，将待测培养液放入离心管中，用清水离心洗涤1~5次后，进行干燥。干燥温度可采用105℃、100℃或红外线烘干，也可在较低的温度（80℃或40℃）下进行真空干燥，然后称干重。以细菌为例，一个细胞一般重约10 另一种方法为过滤法。丝状真菌可用滤纸过滤，而细菌则可用醋酸纤维膜等滤膜进行过滤。过滤后，细胞可用少量水洗涤，然后在40℃下真空干燥，称干重。以大肠杆菌为例，在液体培养物中，细胞的浓度可达2×108 这种方法较适合于丝状微生物的生长量的测定，对于细菌来说，一般在项目室或生产实践中较少使用。 2.代谢活动法 从细胞代谢产物来估算。在有氧发酵