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人的外周血淋巴细胞培养 摘 要 ： 正常情况下哺乳动物的外周血中没有分裂相，这是由于外周血中的小淋巴细胞 多处于 G0 期。但在一定条件下，外周血中的小淋巴细胞受刺激转化成淋巴母细胞，随后进 入有丝分裂。本实验介绍人外周血淋巴细胞的培养方法，染色体标本的制备和正常人染色体 的组型分析。[1] 关键词： 外周血淋巴细胞 低渗处理 空气干燥法 染色体组型分析 前 言：人体外周血细胞培养是制备染色体标本的常用方法。此方法取材方便，用血量少 操作简便。 1960 年 Nowell 和 Morhead 验证，使红细胞凝集从而能分离出白细胞的植物凝集素 （phytohaemagglutinin PHA ）是人和其他动物淋巴细胞的有丝分裂的刺激剂。在PHA 的作 用下，原来处于 G0 期的淋巴细胞转换为淋巴母细胞，进而进行有丝分裂。这样经过短期培 养，以秋水仙素或其衍生物秋水仙胺进行处理，经过低渗和固定，就可获得大量的处于有丝 [2] 分裂时期的细胞 ，因为秋水仙素(或秋水酰胺)可通过干扰微管组装而抑制纺锤丝形成，使 细胞分裂顺利进入后期而停滞于中期，从而可在短期内积累大量最适于进行染 色体分中期 分裂相。此外，秋水仙素还能使染色单体缩短、分开，使染色体呈 现明显形而利于辨认。 淋巴细胞经过培养以后，形成了体外活跃生长的细胞群体，经过空气干燥法制片。所 谓空气干燥法，实际上是将细胞经过秋水仙素—低渗处理—充分的固定—滴片等步骤之后 再载玻片上得到染色体制片的技术。有时，有人把滴片的步骤叫做染色体分散，也有人把这 一步和随后的干燥称为空气干燥法。“空气干燥”就是滴片后，不加热或任何处理，使载玻 片在室温中自然干燥的方法。[3] 淋巴细胞的培养已成为制备染色体的最主要的方法。因为该法材料便宜易得，对同一 个体可进行连续观察，并可得到优良的染色体制片。各种因素的作用效应（如病毒、电离辐 射、化学试剂等）可在淋巴细胞的培养条件下进行观察，从而可进行多种在体内无法进行的 研究。本方法已在临床医学、病毒学、药理学、遗传毒理学等方面广泛应用。[2] 染色体标本制备过程中有两个重要环节，其原理是：(1)低渗处理：目的是使水分通过 细胞膜向细胞内渗入，导致转化的淋巴细胞，染色体进一步分散而利于分析。同时，低渗处 理还可使红细胞质膜破裂，经后血影浮于上清中被去除，后续的固定过程主要针对淋巴细胞 改善了淋巴细胞的固定质量及标本质量。(2) 固定：目的在于尽快使细胞的结构固定于接近 存活的状态，以便作进一步处理，若不固定则可因细胞内蛋白质分解而导致结构变化。染色 体研究中常用固定液为甲醇一冰醋酸(3 ：1)固定液。冰醋酸渗透力强，固定迅速，但易使组 织膨胀而甲醇则可使组织收缩，两者混合使用能抵消各自的缺点，得到较 好的固定效果。 1.材料方法 1.1 材料 人的外周血淋巴细胞。 1.2 器具 采血针、20mL 培养瓶、毛细管、离心管、载玻片和盖玻片、显微镜、恒温箱、离心机、 电子天平、分析天平、精密PH 试纸、移液管、烧杯、酒精灯、移液枪 1.3 药品 1.3.1 RPMI“1640”培养基 称取“1640”粉末 1.05 g ，用 100 mL 的双蒸水溶解，溶解后 pH 值调至 6.0 。每 1000 毫升溶液加 NaHCO 1.0 克，校正 PH 到 7.1 。 3 1.3. 2 肝素 作为抗凝剂使用。称取该粉末 8 mg （每mg 含 126 单位） 用 2 mL 的生理盐水溶解 此溶液的浓度为 504 单位/mL 。 1.3.3 生理盐水 用 0.9 克 NaCL 加入 100mL 蒸馏水中，配制溶液。 1.3.4 秋水仙素 作为有丝分裂的阻止剂，它能改变细胞质的粘度，抑制细胞分裂时纺锤体形成，使细 胞分裂停留在中期。称取秋水仙素 1mg，用25mL 生理盐水溶解，然后放入冰箱 4 ℃保存。 使用时用 1mL 注射器吸取该溶液 0.1mL 加入 5mL 的培养物中，其最终浓度为0.8 微克/毫升。 1.3.5 植物凝血素 （PHA ） 是淋巴细胞有丝分裂刺激剂，本实验采用的是市面上购买的 PHA 粉末，一个针剂为 0.2mL 。将 1 瓶粉末溶在 2mL 的蒸馏水中