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重庆大学研究生专业实验教学 实验报告书 实验课程名称： 凝胶电泳实验 实验指导教师： 学 院： 专业及类别： 生物学 学 号： 姓 名： 实验日期： 成 绩： 重庆大学研究生院制 一、实验目的 1.理解凝胶电泳的分类及琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳实验的基本原理。 2.熟练琼脂糖凝胶电泳实验的基本操作。 3.通过实验了解凝胶电泳实验的注意事项并在以后的实验中尽量避免。 4.利用琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 纯度、浓度和分子量以及分离大小不同的 DNA 片段。 5.了解聚丙烯酰胺凝胶电泳测定DNA 和蛋白分子量大小的方法。 二、实验材料、用具及试剂 1.材料：菌落 PCR 产物（待检测 DNA 片段）； 2.用具：①琼脂糖凝胶电泳：电泳仪，水平板型电泳槽，电子天平，微量移液器（10µl）， 枪头，三角瓶，点样板，梳子，微波炉，凝胶成像 仪； ②聚丙烯酰胺凝胶电泳：垂直板电泳槽，稳压稳流电泳仪，梳子； 3.试剂：琼脂糖，1×TAE 缓冲液，载样缓冲液（Loading buffer ），goldviwe 染料， DL5,000 DNA Marker (Takara) 。 三、实验原理 核酸凝胶电泳是分子克隆核心技术之一，用于分离、鉴定和纯化 DNA 或 RNA 片段，具有以下优点：便于分离、便于检测和便于回收。其工作原理相对而言比 较简单、主要用到了物理学的电荷理论。 当一种分子被放置在电场当中时，它们就会以一定的速度移向适当的电极， 这种电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳的迁移率。它同电场的强度和 电泳分子本身所携带的净电荷数成正比。也就是说，电场强度越大、电泳分子所 携带的净电荷数量越多，其迁移的速度也就越快，反之则较慢。由于在电泳中使 用了一种无反应活性的稳定的支持介质，如琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺胶等，从而 降低了对流运动，故电泳的迁移率又是同分子的摩擦系数成反比的。已知摩擦系 数是分 子的大小、极性及介质粘度的函数，因此根据分子大小的不同、构成或形 状的差异，以及所带的净电荷的多少，便可以通过电泳将蛋白质或核酸分子混合 物中的各种成分彼此分离开来。在生理条件下 ，核酸分子的糖-磷酸骨架中的磷酸 基因呈离子状态从这种意义上讲 ，D N A 和 RNA 多核苷酸链可叫做多聚阴离子 ( Polyanions ) 。因此，当核酸分子被放置在电场中时，它们就会向正电极的方向 迁移。由于糖- 磷酸骨架结构上的重复性质，相同数量的双链 DNA 几乎具有等量 的净电荷，因而它们能以同样的速度向正电极方向迁移。在一定的电场强度下， DNA 分子的这种迁移速度，亦即电泳的迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构 型，分子量较小的 DNA 分子比分子量较大的 DNA 分子迁移要快些。这就是应用 凝胶电泳技术分离 DNA 片段的基本原理。 聚丙烯酰胺凝胶电泳，普遍用于分离蛋白质及较小分子的核酸。琼脂糖凝胶 孔径较大适用于分离同工酶及其亚型，大分子核酸等应用较广。琼脂糖和聚丙烯 酰胺可以制成各种形状、大小和孔隙度。琼脂糖凝胶分离 DNA 度大小范围较广,不 同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp 至近 50kb 的DNA 段。琼脂糖通常用水平 装置在强度和方向恒定的电场下电泳。聚丙烯酰胺分离小片段 DNA(5-500bp)效果 较好,其分辩力极高,甚至相差 1bp 的DNA 段就能分开。聚丙烯酰胺凝胶电泳很快, 可容纳相对大量的 DNA,但制备和操作比琼脂糖凝胶困难。聚丙烯酰胺凝胶采用垂 直装置进行电泳。目前,一般实验室多用琼脂糖水平平板凝胶电泳装置进行 DNA 电 泳。 3.1 凝胶电泳的分类 按照分离物质来分凝胶电泳可以分为核酸凝胶电泳和蛋白质凝胶电泳；按照 分离介质来分可以分为琼脂糖凝胶电泳技术和 PAGE 凝胶电泳。本次实验我们采用 按介质的分类方法来学习的。 3.1.1 琼脂糖凝胶